当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF CDK4 TOTAL KIT - 50K PTS

HTRF CDK4 TOTAL KIT - 50K PTS

分享给好友

rvty_ls_sds_64CDK4TPEY_US rvty_ls_sds_64CDK4TPEY_UK rvty_ls_sds_64CDK4TPEY_SPA rvty_ls_sds_64CDK4TPEY_ITA rvty_ls_sds_64CDK4TPEY_ELL rvty_ls_sds_64CDK4TPEY_DEU rvty_ls_sds_64CDK4TPEY_FRA

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

总 CDK4 细胞检测可监测 CDK4 蛋白水平。

CDK4（细胞周期蛋白依赖性激酶 4）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员之一（该亚家族还包括 CDK1、CDK2 和 CDK6）。在细胞周期的 G1 期早期，CDK4 通过与细胞周期蛋白 D 相互作用被激活，并对肿瘤抑制因子 RB（视网膜母细胞瘤蛋白）进行单磷酸化，从而启动 G1/S 期转换所需基因的转录。

CDK4 的激活失调会导致细胞分裂失控，这是癌症的一个典型特征。因此，对 CDK4 的抑制是一个活跃的研究领域，尤其是在蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）等新方法出现之后。

工作原理

总 CDK4 检测原理

总 CDK4 检测可定量细胞裂解物中 CDK4 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 CDK4 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK4 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 CDK4 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入总 CDK4 的 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 CDK4 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK4 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

通过 siRNA 实验验证总 CDK2、总 CDK4 和总 CDK6 检测的特异性

将 HeLa 细胞和 HEK293 细胞分别以 40,000 个细胞 / 孔和 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK4 或 CDK6 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK2、总 CDK4 或总 CDK6 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染每种特异性 CDK2、CDK4 或 CDK6 siRNA 的细胞信号降低 77% 至 97%。值得注意的是，当细胞转染 CDK2 siRNA 时，总 CDK6 检测中观察到的微小信号降低是预期的，因为 CDK2 敲低会导致 CDK6 下调（Bačević等人，《科学报告》，2017；7:13429）。综上所述，这些数据表明 HTRF 总 CDK2、总 CDK4 和总 CDK6 检测对每种激酶都具有特异性，且不会与其他细胞周期 CDK 家族成员发生交叉反应。

人源和鼠源细胞系中总 CDK4 水平的评估

将人细胞系 HEK293、MCF-7、HeLa 以及鼠源细胞系 NIH-3T3 在 T175 培养瓶中培养 48 小时，然后用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）裂解。通过将 16µL 样品转移至 384 孔小体积白色微孔板中并加入 4µL HTRF 总 CDK4 检测抗体，对每种细胞裂解物的系列稀释液进行总 CDK4 含量分析。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 CDK4 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HEK293 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK4 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 CDK4 检测时，400 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法获得最小化学发光信号也需要相同数量的细胞。因此，在此条件下，HTRF 总 CDK4 检测与蛋白质印迹法的灵敏度相当。

简化通路

CDK4 在细胞分裂周期中的作用

CDK4（细胞周期蛋白依赖性激酶 4）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员之一（该亚家族还包括 CDK1、CDK2 和 CDK6）。

有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导细胞周期蛋白 D 的合成，触发细胞进入细胞周期的 G1 期。随后，细胞周期蛋白 D 与 CDK4 和 CDK6 相互作用形成活性复合物。这两种被激活的激酶能够对肿瘤抑制因子 RB（视网膜母细胞瘤蛋白）进行单磷酸化，此时 RB 仍与转录因子 E2F 结合，但部分基因（如细胞周期蛋白 E）可被转录。在 G1 期晚期和 S 期早期，细胞周期蛋白 E 与 CDK2 相互作用并激活 CDK2，CDK2 进而磷酸化 RB 上的其他位点，导致其完全失活。因此，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导表达，例如细胞周期蛋白 A，它随后与 CDK2 相互作用形成细胞周期蛋白 A/CDK2 复合物。CDK2 最终磷酸化 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶，这些磷酸酶进而激活 CDK1，而 CDK1 是细胞分裂周期中 G2 期和 M 期进程所必需的。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

没有数据

货号：64CDK4TPEY

一键复制

参考价格 ¥ 545226.97

产品规格

请咨询￥545226.97

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价