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HTRF (H) CDK7 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 CDK7 细胞检测可监测 CDK7 蛋白水平。

细胞周期蛋白依赖性激酶 7（CDK7）在细胞中具有双重功能：一方面作为 CDK 激活激酶（CAK），通过磷酸化 CDK1、CDK2 和 CDK4/6 来调节细胞周期进程；另一方面，它也是转录因子 II H（TFIIH）的组成部分，通过磷酸化 RNA 聚合酶 II 的 C 末端结构域（CTD）来调节转录起始。

因此，抑制 CDK7 有望通过调控多个细胞周期检查点来恢复受控的细胞周期，并且通过肿瘤特异性转录调控，已成为一种潜在的新型癌症治疗方法。

工作原理

总 CDK7 检测原理

总 CDK7 检测可定量细胞裂解物中 CDK7 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 CDK7 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK7 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并且提供了一种在无需洗涤的检测格式中评估蛋白质表达的方法。

总 CDK7 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后加入总 CDK7 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 CDK7 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK7 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

通过 siRNA 实验验证总 CDK7 检测的特异性

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（10,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7、CDK9 或 CDK12 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK7 检测抗体。另外，将 4 µL 裂解物（补充 12 µL 稀释液 #11）也转移到微孔板中，使用 GAPDH 管家细胞检测试剂盒（64GAPDHPET/G/H）监测 GAPDH 水平。孵育过夜后，记录两种试剂盒的 HTRF 信号。

与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 CDK7 siRNA 的细胞信号降低了 73%。转染 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK9 和 CDK12 siRNA 的细胞未观察到信号降低。在所有测试条件下，测得的 GAPDH 水平保持不变。数据表明，HTRF 总 CDK7 检测对 CDK7 蛋白的检测具有特异性，不会与其他 CDK 家族成员发生交叉反应。

人细胞系中总 CDK7 水平的评估

将各种人细胞系（贴壁细胞 HeLa、MCF7 或 SHSY5Y 细胞，以及悬浮细胞如 K562 细胞）以 100,000 个细胞 / 孔接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK7 检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

HTRF 总 CDK7 检测与蛋白质印迹法的比较

HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK7 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 CDK7 检测时，1250 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用带有 ECL 检测的蛋白质印迹法则需要 5,000 个细胞。因此，在这些条件下，HTRF 总 CDK7 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

CDK7 在细胞分裂周期中的作用

CDK 传统上分为两个亚家族成员：协调细胞周期进程的 CDK（CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6）和参与转录的 CDK（CDK7、CDK8、CDK9、CDK12 和 CDK13）。

CDK7（细胞周期蛋白依赖性激酶 7）既是 CDK 激活激酶（CAK），可磷酸化细胞周期 CDK（CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6），也是通用转录因子 TFIIH 的组成部分，通过磷酸化 RNA 聚合酶 II 的 C 末端结构域（CTD）来调节转录起始。

规格参数

其他规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 4
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64CDK7TPEY

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