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HTRF RB TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

基于细胞的总 Rb 检测旨在监测 Rb 蛋白（包括磷酸化和非磷酸化形式）的表达水平。它使用与我们的磷酸化 Rb 试剂盒相同的缓冲液，能够从单个样品中分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地解读细胞周期蛋白 - Cdk 通路。由于 Rb 在细胞周期进程中起着核心作用，因此它是肿瘤疾病研究的重要靶标。

工作原理

总 Rb 检测原理

总 Rb 检测可定量细胞裂解物中 Rb 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 Rb 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 Rb 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 Rb 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 Rb HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 Rb 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 Rb 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在 HCT-116 细胞中，帕博西尼（Palbociclib）可有效抑制视网膜母细胞瘤蛋白的磷酸化并略微降低该蛋白的总量

在 HCT-116 细胞中，帕博西尼可有效抑制视网膜母细胞瘤蛋白的磷酸化并略微降低该蛋白的总量。将 HCT-116 细胞以 50 µL 的体积接种到 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。6 小时后，用不同浓度的帕博西尼处理细胞（额外加入 50 µL 体积），处理 19 小时。

移除培养基后，用 50 µL 补充的裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 Rb（Ser780）、磷酸化 Rb（Ser807/811）或总 Rb 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

用细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk4 和 Cdk6）抑制剂帕博西尼处理后，Rb 的 Ser780 和 Ser807/811 位点磷酸化水平显著降低，同时蛋白质总量也减少（如 Liu 等人在 2017 年《Plos》期刊中所报道）。

在人类 HCT116 细胞上使用总 Rb 细胞检测进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将人类 HCT116 细胞在 T175 培养瓶中于 5% CO₂、37°C 条件下培养。当细胞汇合度达到 80% 时，裂解细胞并通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，最后加入总 Rb 细胞试剂盒试剂。平行比较显示，HTRF 总检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 27 倍。

简化通路

细胞分裂周期中的视网膜母细胞瘤蛋白
110 kDa 的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）属于口袋蛋白家族，该家族还包括 p107 和 p130。

Rb 作为肿瘤抑制因子，调控细胞周期进程。

使该蛋白失活的突变会导致视网膜母细胞瘤的发生，此时视网膜细胞无法更新，且会受到高强度诱变紫外线的照射。

在没有有丝分裂信号时，活性状态的低磷酸化 Rb 会结合并抑制进入 S 期所需的 E2F 转录因子。

通过使 E2F 保持失活状态，Rb 将细胞维持在 G1 期，阻止细胞周期进展。

在有丝分裂信号存在时，Rb 会被 cyclin D-CDK4/6 和 cyclin E-CDK2 依次磷酸化并失活。这一磷酸化事件会促使 E2F 转录因子释放。

最终，E2F 激活多种基因的转录，如周期蛋白、CDK、胸苷激酶或 PCNA 等，这些基因在 DNA 合成与复制以及细胞分裂中发挥着重要作用。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64RBTPEY

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