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HTRF CREB P-S133 KIT - 10K PTS

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概述

磷酸化 CREB（S133）试剂盒最适用于定量检测在 S133 位点发生磷酸化的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB），从而能够结合细胞中 CREB 的稳态水平来检测其磷酸化状态。CREB 作为一种转录因子，在 MAPK/ERK 通路下游传递信号，并可被多种通路激活，如 MAPK/ERK、PI3K/AKT 及应激信号通路。CREB 在促进神经元可塑性、认知能力、细胞增殖、存活及葡萄糖稳态中发挥关键作用。

工作原理

磷酸化 CREB（S133）检测原理

磷酸化 CREB（S133）检测可测量在 S133 位点发生磷酸化的 CREB。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 CREB（S133）检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则可识别该蛋白质（与磷酸化状态无关）。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且在免洗涤的检测形式下为评估蛋白质的磷酸化状态提供了方法。

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磷酸化 CREB（S133）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 CREB（S133）HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

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磷酸化 CREB（S133）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 CREB（S133）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

葡萄糖剂量反应：Min6 细胞的总 CREB 和磷酸化 CREB 检测

将小鼠胰腺 β 细胞 Min6 以 70Kc / 孔的密度接种到经培养处理的 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下用完全培养基培养 6 天。用 KRB（克雷布斯 - 林格缓冲液）洗涤细胞，在 KRB 中静置 2 小时后，用 50 µL KRB 和不同浓度的葡萄糖在 37°C 条件下刺激细胞 5 分钟。裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测量总 CREB 和磷酸化 CREB。

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福司柯林（Forskolin）对 NIH 3T3 细胞的剂量反应

将小鼠 NIH 3T3 细胞（50,000 个细胞 / 孔）用不同浓度的福司柯林在 37°C 条件下刺激 30 分钟。裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测量磷酸化 CREB。

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用磷酸化 CREB 试剂盒检测厄洛替尼（Erlotinib）对 A431 细胞的抑制作用

将 A431 细胞（100,000 个细胞 / 孔）与不同浓度的拮抗剂在 37°C 条件下孵育 30 分钟。然后加入激动剂（EGF）并孵育 10 分钟。裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测量磷酸化 CREB。

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HTRF 与 WB 磷酸化 CREB 检测的比较

培养 800 万个 Hek293 细胞，并用 50 µM 福司柯林刺激。细胞裂解后，收集可溶性组分并离心。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液进行检测，同时采用蛋白质印迹法（WB）和 HTRF 法进行平行比较。结果显示，HTRF 磷酸化 CREB（Ser133）检测与蛋白质印迹法的灵敏度相当。

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简化通路

CREB 简化通路

CREB 是一种碱性亮氨酸拉链（bZIP）家族的细胞转录因子，可通过环磷酸腺苷反应元件激活转录。CREB 能够介导多种生理刺激产生的信号，从而调控广泛的细胞应答。CREB 在促进神经元活动中起关键作用。此外，CREB 信号还参与学习和记忆、细胞增殖和存活、葡萄糖稳态、精子发生及昼夜节律等过程。CREB 可被多种信号通路（包括 Erk、Ca²⁺和应激信号通路）在 Ser133 位点磷酸化而激活。参与 CREB Ser133 位点磷酸化的激酶包括 p90RSK、MSK、CaMKIV、PKA 和 MAPKAPK-2。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64CREPEH

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