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HTRF (H/M) CDK9 TOTAL KIT - 500 PTS 人源总周期蛋白依赖性激酶9 检测试剂盒

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品牌： Revvity

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概述

总 CDK9 细胞检测可监测 CDK9 蛋白水平。

CDK9 与周期蛋白 T 或 K 结合，也被称为阳性转录延伸因子（P-TEFb），是一种通用转录因子，通过磷酸化 RNA 聚合酶 II（RNAP II）的 C 末端尾域（CTD）来调控转录延伸。这一关键功能以及癌症中存在转录程序失调的证据，使得 CDK9 成为抗癌治疗的热门靶点。

工作原理

总 CDK9 检测原理

总 CDK9 检测用于定量细胞裂解物中 CDK9 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 CDK9 检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK9 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测形式下为评估蛋白的表达水平提供了手段。

human-mouse-total-CDK9-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK9 检测试剂盒）

总 CDK9 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 CDK9 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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总 CDK9 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK9 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

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检测验证

通过 siRNA 实验验证总 CDK9 检测的特异性

将 HeLa 细胞以 10,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7、CDK9 或 CDK12 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，随后加入 4µL HTRF 总 CDK9 检测抗体。另外，将 4µL 裂解物（补充有 12µL 11 号稀释剂）也转移到微孔板中，使用 GAPDH 管家细胞试剂盒（64GAPDHPET/G/H）监测 GAPDH 水平。过夜孵育后记录两种试剂盒的 HTRF 信号。

与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 CDK9 siRNA 的细胞信号降低了 68%。转染 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7 和 CDK12 siRNA 的细胞未观察到信号降低。在所有测试条件下，测得的 GAPDH 水平保持不变。这些数据表明，HTRF 总 CDK9 检测对 CDK9 蛋白的检测具有特异性，且不会与其他 CDK 家族成员发生交叉反应。

human-mouse-total-CDK9-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK9 检测试剂盒）

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不同细胞系中总 CDK9 水平的评估

将各种细胞系（贴壁细胞 HeLa、MCF7、SHSY5Y、NIH-3T3（小鼠）细胞，或悬浮细胞如 K562 细胞）以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK9 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

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使用 CDK9 PROTAC 降解总 CDK9

将 HeLa 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。然后用溶媒（DMSO）、CDK9 PROTAC（沙利度胺 - SNS-032）、CDK9 结合剂（SNS-032）、CRBN 结合剂（沙利度胺）或 1µM 无关 PROTAC 在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 4 小时。用 50µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞后，将相同的裂解物依次分装到小体积检测白色板中：16µL 用于总 CDK9 检测，另外 4µL（补充有 12µL 11 号稀释剂）用于使用 HTRF GAPDH 管家试剂盒（64GAPDHPET/G/H）检测 GAPDH 水平。加入 4µL 相应的试剂盒检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。与经溶媒（DMSO）处理的细胞相比，CDK9 PROTAC（沙利度胺 - SNS-032）诱导 CDK9 蛋白降解，信号降低 84%。经 CDK9 结合剂、CRBN 结合剂或无关 PROTAC 处理的细胞未观察到信号降低。在所有测试条件下，测得的 GAPDH 水平保持不变（无细胞毒性）。

human-mouse-total-CDK9-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK9 检测试剂盒）

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HeLa 和 MCF7 细胞中总 CDK9 的降解

将 HeLa 和 MCF7 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。然后用递增浓度的 CDK9 PROTAC（沙利度胺 - SNS-032）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 4 小时。用 50µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞后，将相同的裂解物依次分装到小体积检测白色板中：16µL 用于总 CDK9 检测，另外 4µL（补充有 12µL 11 号稀释剂）用于使用 HTRF GAPDH 管家试剂盒（64GAPDHPET/G/H）检测 GAPDH 水平。加入 4µL 相应的试剂盒检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，结果显示 HeLa 和 MCF7 细胞经 CDK9 PROTAC 处理后，总 CDK9 呈剂量依赖性降解（半数最大降解浓度分别为 166nM 和 60nM），而 GAPDH 水平保持恒定。

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HTRF 总 CDK9 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK9 检测试剂。使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

使用 HTRF 总 CDK9 检测时，300 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用带有 ECL 检测的蛋白质印迹法则需要 10,000 个细胞。因此，在这些条件下，HTRF 总 CDK9 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 32 倍。

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简化通路

CDK9 在细胞分裂周期中的作用

传统上，CDK 分为两个亚家族成员：协调细胞周期进程的 CDK（CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6）以及转录 CDK（CDK7、CDK8、CDK9、CDK12 和 CDK13）。

CDK9（细胞周期蛋白依赖性激酶 9）与周期蛋白 T 或 K 结合，是多蛋白复合体 TAK/P-TEFb 的组成部分，通过磷酸化 RNA 聚合酶 II（RNAP II）的 C 末端尾域（CTD）来调控转录延伸。CDK9 是成熟 RNA 生成过程中的关键参与者。

human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
自动化兼容性：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64CDK9TPEG

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