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HTRF (H/M) CHK1 P-S345 KIT - 500 PTS 磷酸化检测点蛋白激酶（丝氨酸345）检测试剂盒

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法能够快速、定量地检测丝氨酸 345 位磷酸化的 CHK1，以此作为 DNA 损伤应答（DDR）时 ATR/CHK1 信号通路的读出指标。

在应对 DNA 损伤（例如单链断裂（SSBs））时，ATR-Chk1 通路和复制检查点应答会被激活，介导 G2/M 检查点以阻止细胞周期

进程，为 DNA 修复争取额外时间。ATR 通过其相互作用伙伴 ATRIP 被招募到单链 DNA-RPA 处，这会导致 Chk1 磷酸化和激活，进而诱导下游信号传导。

工作原理

HTRF 磷酸化 CHK1 丝氨酸 345 检测原理

磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）检测用于测量丝氨酸 345 位磷酸化的 CHK1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）检测使用两种标记抗体：一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会形成涉及两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测形式下为评估蛋白质的磷酸化状态提供了方法。

human-mouse-phospho-CHK1-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化 CHK1 检测试剂盒）

磷酸化 CHK1 丝氨酸 345 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）HTRF 检测试剂。

该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 CHK1 丝氨酸 345 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行。无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

human-mouse-phospho-CHK1-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化 CHK1 检测试剂盒）

检测验证

人 / 小鼠 CHK1 检测的兼容性：新制癌菌素剂量反应曲线

将人 HEK293 细胞或小鼠 NIH/3T3 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用新制癌菌素以剂量反应方式处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂）。然后用 50µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）或总 CHK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，新制癌菌素诱导单链 DNA 损伤，导致 CHK1 磷酸化呈剂量依赖性增加，而对人或小鼠细胞系中总蛋白的表达水平无任何影响。

human-mouse-phospho-CHK1-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化 CHK1 检测试剂盒）

诱导 DNA 损伤的化合物对 CHK1 磷酸化和总蛋白的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用新制癌菌素、羟基脲、阿霉素和依托泊苷以剂量反应方式在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。然后移除培养基，用 50µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）或总 CHK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

不同化合物显示出不同的反应。新制癌菌素、羟基脲和依托泊苷可诱导单链断裂（SSB），导致 CHK1 完全磷酸化。倾向于引发双链断裂（DSB）的阿霉素则使 CHK1 部分磷酸化。新制癌菌素、羟基脲、依托泊苷和阿霉素的半数有效浓度（EC50）分别为 1.2µM、0.1mM、3.3µM 和 7.1µM。

此外，新制癌菌素的 80% 有效浓度（EC80）经测定为 3µM，该浓度被用于评估 ATR/CHK1 通路的抑制剂。

另一方面，这 4 种化合物均未影响 CHK1 总蛋白的表达水平。

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ATR/CHK1 或 ATM/CHK2 通路抑制剂对 CHK1 磷酸化和总蛋白的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 3 种 ATR 或 ATM 通路抑制剂以剂量反应方式在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。然后用 3µM 新制癌菌素（EC80）在 37°C、5% CO₂条件下再处理细胞 2 小时。移除培养基，然后用 50µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）或总 CHK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

已知咖啡因是一种温和的 ATR/ATM 通路抑制剂，UCN-1 是一种强效 CHK1 抑制剂，而 KU55933 仅是 ATM 通路抑制剂。正如预期，UCN-1 能以高 potency（半数抑制浓度（IC50）为 15nM）完全抑制 CHK1 磷酸化，而咖啡因的效力较弱。KU55933 化合物未诱导 CHK1 磷酸化抑制。

另一方面，这 3 种测试化合物均未影响 CHK1 总蛋白的表达水平。

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HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）检测与蛋白质印迹法的比较

将 HEK293 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。

移除培养基后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1x）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的 1 号裂解缓冲液（1x）对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 纯样品和每种稀释液转移至 384 孔小体积微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化丝氨酸 345 CHK1 检测试剂。过夜后记录信号。

将等量的裂解物上样到凝胶中，对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

在这些条件下，HTRF 磷酸化丝氨酸 345 CHK1 检测与蛋白质印迹法的灵敏度相当。

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简化通路

ATM/CHK2 和 ATR/CHK1 信号通路

双链断裂（DSBs）或单链断裂（SSBs）是最有害的损伤之一，可能威胁基因组完整性。这类损伤可由细胞代谢物的作用或 DNA 损伤剂（如遗传毒性化合物、化疗药物、紫外线（UV）照射或电离辐射）诱导产生。

DNA 损伤应答（DDR）主要由共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）和共济失调毛细血管扩张症及 Rad3 相关蛋白（ATR）控制，它们是磷酸肌醇 3 - 激酶（PI3K）相关激酶（PIKK）蛋白激酶家族的两个成员。

在应对 DNA 损伤（SSBs）时，ATR–Chk1 通路和复制检查点应答会被激活，介导 G2/M 检查点以阻止细胞周期进程，为 DNA 修复争取额外时间。ATR 通过其相互作用伙伴 ATRIP 被招募到单链 DNA-RPA 处，这会导致 Chk1 磷酸化和激活。CHK1 激活涉及信号转导通路，直至调节 cdc2 / 周期蛋白 B1 活性和控制 Cdc25A。

许多癌症在 G1/S 检查点存在缺陷，包括那些 p53 缺陷的癌症。如果由于 DNA 损伤，G1 检查点缺陷细胞中的 ATR 通路受到抑制，细胞将不会引发细胞周期停滞以进行 DNA 修复，从而导致癌细胞死亡。因此，抑制 ATR 通路已成为一种有吸引力的策略，可选择性地使 p53 缺陷细胞对损伤 DNA 的化疗药物敏感。

创新小分子 Chk1 和 Chk2 抑制剂的鉴定，以及检查点调节新策略与传统放疗和化疗方式相结合的验证，为改善癌症治疗带来了希望。

human-mouse-phospho-CHK1-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化 CHK1 检测试剂盒）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
自动化兼容性：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64CHK1S5PEG

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