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HTRF (H) CHK2 TOTAL KIT - 10K PTS

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品牌： Revvity

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概述

总 CHK2 细胞检测试剂盒旨在监测 CHK2 的表达水平，无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。

该试剂盒与我们的磷酸化 CHK2 苏氨酸 68 试剂盒兼容，能够从单个样品中分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地解读 ATM/CHK2 通路。

工作原理

HTRF 总 CHK2 检测原理

总 CHK2 检测可对细胞裂解物中 CHK2 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 CHK2 检测使用两种标记抗体：一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CHK2 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测形式下为评估蛋白的表达水平提供了方法。

human-total-CHK2-detection-kit（人总 CHK2 检测试剂盒）

HTRF 总 CHK2 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 CHK2 HTRF 检测试剂。

该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

human-total-CHK2-detection-kit（人总 CHK2 检测试剂盒）

HTRF 总 CHK2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CHK2 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行。无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

human-total-CHK2-detection-kit（人总 CHK2 检测试剂盒）

检测验证

新制癌菌素对总 CHK2 和磷酸化苏氨酸 68-CHK2 检测的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用新制癌菌素以剂量反应方式在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。然后用 50µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK2（苏氨酸 68）或总 CHK2 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，新制癌菌素诱导单链和双链 DNA 损伤，导致 CHK2 磷酸化呈剂量依赖性增加，而对 CHK2 总蛋白的表达水平无影响。

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诱导 DNA 损伤的化合物对 CHK2 磷酸化和总蛋白的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用新制癌菌素、羟基脲、阿霉素和依托泊苷以剂量反应方式在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。然后移除培养基，用 50µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK2（苏氨酸 68）或总 CHK2 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

不同化合物呈现出不同的反应。已知新制癌菌素、阿霉素和依托泊苷会诱导双链断裂（DSB），进而导致 CHK2 磷酸化。另一方面，倾向于诱导单链断裂（SSB）的羟基脲仅使 CHK2 部分磷酸化，且效力较弱。新制癌菌素、阿霉素、依托泊苷和羟基脲的半数有效浓度（EC50）经评估分别为 0.1µM、1.5µM、0.4µM 和 0.6mM。

此外，新制癌菌素的 80% 有效浓度（EC80）经评估为 0.3µM，该浓度被用于评估 ATM/CHK2 通路的抑制剂。

这 4 种化合物均未对 CHK2 总蛋白的表达水平产生影响。

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ATR/CHK1 或 ATM/CHK2 通路抑制剂对 HTRF 磷酸化苏氨酸 68-CHK2 和总 CHK2 试剂盒的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 3 种 ATR 或 ATM 通路抑制剂以剂量反应方式在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。随后，用 0.3µM 新制癌菌素（EC80）在 37°C、5% CO₂条件下再处理细胞 2 小时。移除培养基，用 50µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK2（苏氨酸 68）或总 CHK2 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

已知咖啡因是一种温和的 ATR/ATM 通路抑制剂，UCN-1 是一种强效 CHK1 抑制剂，KU55933 是一种选择性 ATM 通路抑制剂。正如预期，UCN-1 对 CHK2 磷酸化无影响。咖啡因可降低 CHK2 磷酸化水平，但效力较弱。KU55933 能以较高的效力（半数抑制浓度（IC50）：1µM）完全抑制 CHK2 磷酸化。

这 3 种测试化合物均未影响 CHK2 总蛋白的表达水平。

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HTRF 总 CHK2 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HEK293 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。

移除培养基后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1x）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的 1 号裂解缓冲液（1x）对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 纯样品和各稀释液转移至 384 孔小体积微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CHK2 检测试剂。过夜后记录信号。

将等量的裂解物上样到凝胶中，对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 CHK2 检测与蛋白质印迹法的灵敏度相当。

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简化通路

ATM/CHK2 和 ATR/CHK1 信号通路

双链断裂（DSBs）或单链断裂（SSBs）是最有害的损伤之一，会威胁基因组的完整性。这类损伤可由细胞代谢物的作用或 DNA 损伤剂（如遗传毒性化合物、化疗药物、紫外线（UV）照射或电离辐射）诱导产生。

DNA 损伤应答（DDR）主要由共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）和共济失调毛细血管扩张症及 Rad3 相关蛋白（ATR）控制，它们是磷酸肌醇 3 - 激酶（PI3K）相关激酶（PIKK）蛋白激酶家族的两个成员。

在应对 DNA 损伤（DSBs）时，ATM–Chk2 通路和复制检查点应答会被激活，介导 G1/S 检查点以阻止细胞周期进程，为 DNA 修复争取额外时间。

在应对 DNA 双链断裂时，ATM 的激活会导致检查点激酶 Chk2 发生磷酸化。Chk2 是一种在整个细胞周期中均有表达的稳定蛋白，在没有 DNA 损伤的情况下，它基本处于失活状态。其激活包括二聚化和自磷酸化（苏氨酸 383 和苏氨酸 387），并会诱导下游信号效应分子（如肿瘤抑制蛋白 p53、CdC25C）的激活，还会调控 cdk2 / 细胞周期蛋白 A 的活性。

在放射治疗期间对 Chk2 进行化学抑制，可能会保护淋巴细胞或肠上皮等敏感组织免受放疗或引起双链断裂的药物的副作用影响。这里的关键问题是确定合适的 Chk2 抑制剂，并测试这种策略是否能在不增加肿瘤发生率的情况下应用。

新的 Chk2 小分子抑制剂的发现，以及检查点调节新策略与传统放疗和化疗方式相结合的验证，为改善癌症治疗带来了希望。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
自动化兼容性：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64CHK2TPEH

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