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HTRF (H/M) COFILIN P-S3 KIT - 50K PTS

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概述

本试剂盒旨在快速检测细胞上清液和全细胞中的磷酸化丝切蛋白（Ser3）。肌动蛋白结合蛋白是一类丰富的细胞蛋白，通过介导肌动蛋白聚合和重塑来调节细胞功能。丝切蛋白（Cofilin）是肌动蛋白丝动态的调节因子，是一种约 21kDA 的小蛋白，在所有脊椎动物中广泛表达，并在真核细胞中自由扩散。激酶在 Ser-3 位点的磷酸化会减弱丝切蛋白的肌动蛋白结合活性。相反，Ser-3 位点的去磷酸化会增强丝切蛋白诱导的肌动蛋白解聚。

工作原理

磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测原理

磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测可测定在 Ser3 位点发生磷酸化的丝切蛋白。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接相关，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

人 - 鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒

磷酸化丝切蛋白（Ser3）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，接着将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化丝切蛋白（Ser3）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

人 - 鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒

磷酸化丝切蛋白（Ser3）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化丝切蛋白（Ser3）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

人 - 鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒

检测验证

使用 LIMK1 抑制剂和星形孢菌素调节 HTRF 磷酸化丝切蛋白（Ser3）/ 总丝切蛋白

将 HeLa 细胞以 10,000 个细胞 / 孔的密度接种在完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后用不同浓度的星形孢菌素或 LIMK1 激酶抑制剂（TH257）分别处理细胞 1 小时或 2 小时（37°C、5% CO₂）。随后弃去上清液，向每个孔中加入 50µl 补充的 4 号裂解缓冲液。在温和振荡条件下裂解 30 分钟。将裂解物转移至 384 孔板中，每孔 16µl，然后加入 4µl 总丝切蛋白或磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测试剂。孵育过夜后读取板的信号。

正如预期的那样，两种化合物处理后均导致 Ser3 位点磷酸化的丝切蛋白减少，而总丝切蛋白的表达水平未受影响。

人 - 鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒

神经细胞中的 HTRF 磷酸化丝切蛋白（Ser3）/ 总丝切蛋白检测

将人神经细胞以 10,000 个细胞 / 孔的密度接种在完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的星形孢菌素或 LIMK1 激酶抑制剂（TH257）分别处理细胞 1 小时或 2 小时（37°C、5% CO₂）。之后弃去上清液，向每个孔中加入 50µl 补充的 4 号裂解缓冲液。在温和振荡条件下裂解 30 分钟。将裂解物转移至 384 孔板中，每孔 16µl，然后加入 4µl 总丝切蛋白或磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测试剂。孵育过夜后读取板的信号。

正如预期的那样，两种化合物处理后均导致 Ser3 位点磷酸化的丝切蛋白减少，而总丝切蛋白的表达水平未受影响。

人 - 鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒

使用小干扰 RNA（SiRNA）验证丝切蛋白磷酸化 - S3 检测的 HTRF 特异性

将 HeLa 细胞以 5,000 个细胞 / 孔的密度接种在完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 50nmol 针对丝切蛋白 1 和 / 或丝切蛋白 2 的小干扰 RNA 转染细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后移除转染培养基，向细胞中加入细胞培养基，在 37°C、5% CO₂条件下继续孵育 24 小时。随后弃去上清液，向每个孔中加入 50µl 补充的 4 号裂解缓冲液。在温和振荡条件下裂解 30 分钟。将裂解物转移至 384 孔板中，每孔 16µl，然后加入 4µl 磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测试剂。孵育过夜后读取板的信号。

针对丝切蛋白 1 的小干扰 RNA 使磷酸化丝切蛋白 1 的检测信号降低了 90%，而针对丝切蛋白 2 的小干扰 RNA 则无此效果。数据表明，HTRF 磷酸化丝切蛋白 1 检测具有特异性，仅检测丝切蛋白 1，不与丝切蛋白 2 发生交叉反应。

人 - 鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒

丝切蛋白磷酸化 - S3 检测在人及鼠细胞系中的通用性

将人 HeLa 细胞、HepG2 细胞和鼠 NIH-3T3 细胞以 12,500 个细胞 / 孔的密度接种在完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后弃去上清液，向每个孔中加入 50µl 补充的 4 号裂解缓冲液。在温和振荡条件下裂解 30 分钟。将裂解物转移至 384 孔板中，每孔 16µl，然后加入 4µl 磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测试剂。孵育过夜后读取板的信号。

在多种人和鼠细胞模型中，磷酸化丝切蛋白均能被有效检测到。

人 - 鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒

HTRF 与 WB 检测丝切蛋白磷酸化 - S3 的灵敏度比较

HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养，条件为 37°C、5% CO₂。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下温和振荡裂解细胞 30 分钟。

将细胞裂解物先用补充的裂解缓冲液进行 10 倍稀释，然后进行系列稀释，取 16µl 每种稀释液转移至白色小体积微孔板中，再加入 4µl HTRF 磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测试剂。取等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法（Western Blot）的平行比较。

在这些条件下，HTRF 磷酸化丝切蛋白（Ser3）检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

人 - 鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒

简化通路

丝切蛋白信号通路

肌动蛋白结合蛋白是一类丰富的细胞蛋白，通过介导肌动蛋白聚合和重塑来调节细胞功能。丝切蛋白作为肌动蛋白丝动态的调节因子，是一种约 21kDA 的小蛋白，在所有脊椎动物中广泛表达，并在真核细胞中自由扩散。丝切蛋白通过促进 F - 肌动蛋白解聚和抑制 G - 肌动蛋白聚合来推动肌动蛋白丝的转化，这在真核生物的肌动蛋白丝动态过程中至关重要。激酶在 Ser-3 位点的磷酸化会减弱丝切蛋白的肌动蛋白结合活性，相反，Ser-3 位点的去磷酸化会增强丝切蛋白诱导的肌动蛋白解聚。丝切蛋白的功能还受到多种结合伴侣或活性氧的调节。

尽管丝切蛋白介导的肌动蛋白动态机制已被了解数十年，但近期研究揭示了丝切蛋白失调在神经退行性病理生理过程中的深远影响。例如，在阿尔茨海默病中，氧化应激诱导的丝切蛋白去磷酸化增加与 tau 蛋白缠结和淀粉样 β 斑块的积累有关。在帕金森病中，通过沉默上游激酶激活丝切蛋白会增加 α- 突触核蛋白原纤维进入细胞。丝切蛋白在癌细胞中也存在过表达，可促进细胞运动，是癌症转移的重要调节因子。

人 - 鼠磷酸化丝切蛋白检测试剂盒

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白
目标物种：人、鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 次检测

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货号：64COFS3PEY

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