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HTRF (H/M) CREBBP TOTAL KIT - 500 PTS HTRF人源/鼠源总环磷酸腺苷反应元件结合蛋白结合蛋白检测试剂盒，500测试

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概述

HTRF 总 CREBBP 细胞检测可便捷、准确地检测细胞内总 CREBBP 的水平。该试剂盒与总 p300 试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于这两个家族成员的分析。

CREBBP（CREB 结合蛋白，也称为 CBP 或 KAT3A）及其同源物 p300（也称为 EP300 或 KAT3B）是关键的转录共激活因子。这些赖氨酸乙酰转移酶（KATs）构成了含两个成员的 KAT3 家族。它们通过促进转录机制的组装，以及对核心组蛋白和转录共调节因子上的特定赖氨酸残基进行乙酰化，来控制基因转录。CREBBP 和 p300 作为网络 “枢纽”，可与 400 多种蛋白质相互作用，调节控制多种基本细胞过程（如增殖和稳态）的基因表达。

涉及 CREBBP/p300 的突变或染色体易位会导致基因失调，并可能引发多种人类疾病，如癌症、神经退行性疾病和炎症性疾病。近年来，已开发出 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂用于治疗人类癌症。

工作原理

总 CREBBP 检测原理

HTRF 总 CREBBP 检测可对细胞裂解物中 CREBBP 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 CREBBP 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CREBBP 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，且在免洗涤的检测形式下为评估蛋白的表达水平提供了方法。

human-mouse-total-CREBBP-detection-kit（人 - 鼠总 CREBBP 检测试剂盒）

总 CREBBP 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入总 CREBBP HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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总 CREBBP 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CREBBP 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

3 种 CREBBP/p300 PROTAC 作用机制的表征

实验采用贴壁细胞的双板检测方案进行。将 HeLa 细胞接种到 96 孔培养板中（每孔 70,000 个细胞，使用完全培养基），在 37°C、5% CO₂条件下培养过夜。次日，先用 1 µM 环氧霉素预处理细胞 1 小时，再用 3 种浓度的每种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂（PROTAC CBP/p300 Degrader-1、沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 或 dCBP-1）处理 5 小时，同时使用弹头 GNE-781 作为阴性对照（三种 PROTAC 共用同一种对照）。用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，然后将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，再加入 4 µL HTRF 总 CREBBP 或总 p300 试剂盒检测抗体（HTRF 总 p300 试剂盒，货号 64P300TPEG/Y）。两种检测均在过夜孵育后记录 HTRF 信号。通过将 5 µL 相同裂解物转移至 HTRF 96 孔小体积白色板（货号 66PL96005/025/100）中，然后加入 25 µL ATPlite 1step 检测试剂（ATPlite 1step 发光检测系统，货号 6016736/1/9），评估细胞活力。在暗处孵育 10 分钟后测量发光信号。

处理 5 小时后，三种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂均诱导 CREBBP 和 p300 的信号呈剂量依赖性降低，而弹头 GNE-781 则无此作用，结果与预期一致。如 ATPlite 图表所示，在化合物存在的情况下未观察到细胞毒性作用。最后，在蛋白酶体抑制剂环氧霉素存在时，HTRF 信号得以恢复。综上，我们的结果明确表明，PROTAC 诱导的 CREBBP/p300 降解是由泛素 - 蛋白酶体系统介导的。

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3 种 CREBBP/p300 PROTAC 的剂量效应和时间进程研究

实验在 HeLa 细胞上进行，方法与上一节所述相同，不同之处在于用不同浓度的每种 CREBBP/p300 PROTAC（或弹头 GNE-781）处理细胞 4 小时或 20 小时。如前所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 CREBBP 和总 p300，并使用 ATPlite 1step 发光试剂盒测量细胞活力。

三种 PROTAC 均诱导 CREBBP 和 p300 的剂量依赖性降解，而弹头 GNE-781 则无此作用。这些化合物对两种蛋白的作用相似（如效力和动力学）。两种处理时间后，三种降解剂的效力排名相同，其中沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 的效力分别是 PROTAC CBP/p300 Degrader-1 的 4 倍和 dCBP-1 的 10 倍（基于 DC50 值）。处理 20 小时后，PROTAC CBP/p300 Degrader-1 和 dCBP-1 的效力显著提高（2.5 至 5 倍），沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 的降解效率也从 65% 提高到 80%。值得注意的是，即使处理 20 小时，这些化合物也未诱导明显的细胞毒性作用（ATPlite 1step 检测，数据未显示）。

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总 CREBBP 和总 p300 检测特异性的验证

将 HeLa 细胞接种到 96 孔培养板中（总 CREBBP 检测为 50,000 个细胞 / 孔，总 p300 检测为 12,500 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下培养过夜。次日，用针对人 CREBBP 或其同源物人 p300 的 ON-TARGETplus SMARTPool siRNA 转染细胞，同时使用非靶向 siRNA 作为阴性对照。用 siRNA 孵育 24 小时后，更换培养基再孵育 24 小时，然后用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞。细胞裂解后，如第一部分所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 CREBBP 和总 p300，并使用 ATPlite 1step 发光试剂盒测量细胞活力。

siRNA 实验表明，HTRF 总 CREBBP 和总 p300 试剂盒均能特异性检测目标蛋白，而不会识别该家族的另一个成员。用 CREBBP siRNA 处理使总 CREBBP 检测的信号降低 70%，而敲低 p300 并未导致该检测的信号降低。相反，用 p300 siRNA 处理使总 p300 检测的信号降低 86%，而沉默 CREBBP 基因并未导致该检测的信号降低。在 CREBBP 和 p300 siRNA 存在的情况下，ATPlite 发光信号保持稳定，表明 HTRF 信号的降低与细胞毒性作用无关。

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不同人源和鼠源细胞系中总 CREBBP 水平的评估

实验采用贴壁细胞的双板检测方案进行。将人源细胞系 SH-SY5Y、MCF7、HeLa、A431 和 A549，以及鼠源细胞系 NIH-3T3 和 Neuro-2a 接种到 96 孔培养板中（100,000 个细胞 / 孔，使用完全培养基），在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。次日，用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，再加入 4 µL HTRF 总 CREBBP 试剂盒检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 CREBBP 试剂盒适用于人源和鼠源细胞模型，能有效检测不同表达水平细胞系中的 CREBBP。

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HTRF 总 CREBBP 检测与蛋白质印迹法（WB）的比较

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，在含完全培养基的条件下于 37°C、5% CO₂环境中培养，直至汇合度达到约 90%。用 3 mL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，并用补充的裂解缓冲液对裂解物进行系列稀释。为检测总 CREBBP，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，并加入 4 µL HTRF 总 CREBBP 检测试剂。取等量裂解物进行蛋白质印迹法检测，与 HTRF 检测进行平行比较。

使用 HTRF 总 CREBBP 检测时，仅需 500 个细胞 / 孔即可检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 4,000 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该条件下，HTRF 总 CREBBP 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

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简化通路

CREBBP/p300 信号通路

转录共激活因子 CREBBP 和 p300 通过促进转录机制的组装，以及对核心组蛋白和其他转录调节因子（如转录因子 c-Myc、p53 和 FoxO1）进行乙酰化，来调节基因表达。

CREBBP 和 p300 是许多由细胞内或细胞外信号激活的重要信号通路的核心。它们调节生长因子和激素信号传导，如由核激素受体 AR（雄激素受体）和 ER（雌激素受体）介导的信号传导。其他信号示例包括缺氧、细胞应激（涉及 MAP 激酶 p38、JNK 和 ERK）、高血糖、GPCR 激动剂（诱导 cAMP 信号传导）和细胞因子（由 JAK/STAT 通路介导）。CREBBP/p300 还调节 TLR/IRF-3 通路，以控制先天免疫应答。CREBBP 和 p300 均是 BRD4 占据位点（如 H3K27ac）的组蛋白乙酰化所必需的，也是 BRD4 结合到基因启动子和增强子以调节相关基因转录所必需的。

所有这些通路最终都利用细胞核中的 CREBBP 和 p300 作为下游效应器，来控制关键的细胞功能，如细胞周期调控和分化、胚胎发育和稳态。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64CREBBPTPEG

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