HTRF (H) CYCLIN D1 P-T286 KIT - 50K PTS

概述

这种基于HTRF细胞的检测方法能够便捷、准确地检测苏氨酸286（Thr286）位点磷酸化的细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）。 细胞周期蛋白D家族成员（包括细胞周期蛋白D1、D2和D3）是细胞周期进程的重要调节因子。它们作为细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）的变构调节因子，是生长因子依赖性G1期向S期过渡的关键介导者。 在细胞外有丝分裂刺激存在时，细胞周期蛋白D1会被上调，随后在激酶GSK-3β的作用下，其苏氨酸286位点发生磷酸化，进而通过蛋白酶体降解迅速下调。 细胞周期蛋白D1是一种癌基因，其过表达会导致CDK4/6活性失调，进而引发肿瘤发生。细胞周期蛋白D1过表达可能由基因扩增、染色体重排，或蛋白质降解受损所致。已有研究报道，在多种人类癌症中存在影响其苏氨酸286位点磷酸化的突变和缺失。 检测原理 磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）检测原理 磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）检测可对苏氨酸286位点磷酸化的细胞周期蛋白D1进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测采用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接相关，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。 人源磷酸化细胞周期蛋白检测试剂盒 磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）双板检测方案 双板方案包括：先在96孔板中培养细胞，然后裂解细胞，接着将裂解液转移至小体积检测板中，再加入磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。 人源磷酸化细胞周期蛋白检测试剂盒 磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、处理和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化操作，同时保持稳定的HTRF检测质量。 人源磷酸化细胞周期蛋白检测试剂盒 检测验证 通过小干扰RNA（siRNA）敲低实验验证磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）检测的特异性 将MCF7细胞接种到96孔板中（50,000个细胞/孔），培养24小时。然后用分别靶向细胞周期蛋白D1、D2、D3的siRNA以及作为阴性对照的非靶向siRNA转染细胞。siRNA孵育24小时后，更换培养基再孵育24小时，随后用10μM MG132处理细胞4小时。细胞裂解后，将16μL裂解液转移至小体积白色微孔板中，并加入4μL HTRF磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）检测抗体以检测磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）。同时，将4μL相同的裂解液转移至检测板的其他孔中，使用HTRF GAPDH内参检测试剂盒（货号：64GAPDHPEG、64GAPDHPEH）检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。两种检测均在孵育过夜后记录HTRF信号。 与转染非靶向siRNA的细胞相比，转染靶向细胞周期蛋白D1的siRNA后，磷酸化细胞周期蛋白D1检测的信号降低了80%。相反，敲低细胞周期蛋白D2和D3并未导致信号降低。此外，内参蛋白GAPDH的水平未受siRNA处理的显著影响，这表明在加入细胞周期蛋白D1 siRNA的情况下，磷酸化细胞周期蛋白D1检测中观察到的信号降低并非由细胞毒性引起。综上所述，这些数据表明HTRF磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）检测对细胞周期蛋白D1具有特异性，且不会与其他细胞周期蛋白D家族成员发生交叉反应。 人源磷酸化细胞周期蛋白检测试剂盒 在MG132存在下抑制细胞周期蛋白D1的蛋白酶体降解 将不同密度的人纤维肉瘤细胞系HT-1080接种到96孔培养处理板中，加入完全培养基，在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用10μM MG132处理细胞4小时（或不处理），然后加入50μL补充的1号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡30分钟以裂解细胞。检测步骤：将16μL细胞裂解液转移至小体积白色微孔板中，加入4μL HTRF磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）或总细胞周期蛋白D1检测试剂。孵育过夜后记录HTRF信号。 如预期所示，在蛋白酶体抑制剂MG132存在的情况下，磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）和总细胞周期蛋白D1的水平均升高，这是因为MG132可阻断蛋白质的泛素依赖性蛋白酶体降解，导致其在细胞内积累。 人源磷酸化细胞周期蛋白检测试剂盒 HTRF磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）检测与蛋白质印迹法的比较 将MCF7细胞在T175培养瓶中用完全培养基培养，置于37°C、5% CO₂环境中。孵育48小时后，用10μM MG132处理细胞4小时，然后加入3mL补充的1号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡30分钟以裂解细胞。 使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将16μL各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入4μL HTRF磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）检测试剂。取等量裂解液，同时进行HTRF检测和蛋白质印迹法检测以作对比。 使用HTRF磷酸化细胞周期蛋白D1（苏氨酸286）检测时，每孔3,125个细胞即可检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要12,500个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF磷酸化细胞周期蛋白D1检测的灵敏度是蛋白质印迹法的4倍。 人源磷酸化细胞周期蛋白检测试剂盒规格参数

其他规格 应用领域 细胞信号传导 是否兼容自动化操作 是 品牌 HTRF 检测方式 HTRF 兼容的裂解缓冲液 1号裂解缓冲液 4号裂解缓冲液 分子修饰 磷酸化 产品类别 试剂盒 样品体积 16μL 运输条件 干冰运输 目标类别 磷酸化蛋白 目标物种 人 技术原理 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域 肿瘤学与炎症 单位规格 500个检测点