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HTRF (H) EGFR L858R TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

在接受酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗的表皮生长因子受体（EGFR）突变型非小细胞肺癌患者中，耐药性是癌症靶向治疗面临的主要挑战之一。设计特异性的 PROTAC 化合物来降解 EGFR 突变蛋白，有望为治疗此类患者和克服耐药性提供一种有前景的方法。

工作原理

总 EGFR L858R 检测原理

HTRF 总 EGFR L858R 检测可对细胞裂解物中突变型 EGFR L858R 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 EGFR 突变型 L858R 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 EGFR 突变型 L858R 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。其强度与样品中该蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 EGFR L858R 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再添加总 EGFR L858R HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 EGFR L858R 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 EGFR 突变型 L858R 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

PROTAC® 化合物可诱导突变型 EGFR L858R 降解

将 H3255 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。随后，用浓度递增的 PROTAC®（基于 MS39-SJF1528 - 吉非替尼的 PROTAC 3-MS154 和 SJF1521）处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 16 小时。用 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液裂解细胞后，将 8 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，然后加入 8 µL 补充的 4 号裂解缓冲液和 4 µL HTRF 总 EGFR L858R 检测抗体。孵育过夜后评估 HTRF 信号。

正如预期，结果显示 PROTAC® 分子可诱导 H3255 细胞中突变型 EGFR L858R 呈剂量依赖性减少，并评估了每种化合物的 DC50*。在相同实验条件下，通过 ATPlite™检测测得的 ATP 水平稳定，表明未观察到细胞毒性作用。

DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

通过小干扰 RNA（siRNA）评估总 EGFR L858R 试剂盒的特异性

将 H1975 细胞接种到 96 孔板中（每孔 20,000 个细胞），培养 24 小时。然后用针对 EGFR、ERBB2、ERBB3 和 ERBB4 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 EGFR L858R 检测抗体。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，EGFR siRNA 使信号降低了 79%。在转染 ERBB2、ERBB3 或 ERBB4 siRNA 的细胞中，未观察到信号降低。在相同实验条件下，通过 ATPlite™检测测得的 ATP 水平稳定，表明 EGFR 家族成员的沉默对细胞增殖或活力无影响。

这些结果表明，HTRF 总 EGFR L858R 检测具有特异性，不会检测到其他 HER/ErbB 家族成员。

总 EGFR L858R 检测在相关 EGFR 突变细胞系中得到验证

使用 HTRF 总 EGFR DEL19 试剂盒评估了不同细胞系中总 EGFR L858R 的表达水平：H1975 和 H3255 细胞（表达 EGFR L858R 突变体）、A431 和 A549 细胞（表达野生型 EGFR），以及 H1650 和 HCC827 细胞（表达 EGFR DEL19 突变体）。

将不同细胞系在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养，置于 37°C、5% CO₂条件下。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将每种稀释 2 倍的裂解物各 16 µL 转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 EGFR L858R 检测试剂。

正如预期，在 H1650、HCC827、A431 和 A549 细胞系中未检测到信号，这表明 HTRF 总 EGFR L858R 试剂盒具有特异性，仅检测突变型 EGFR L858R。

HTRF 总 EGFR L858R 检测与蛋白质印迹法的比较

将 H1975 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养，置于 37°C、5% CO₂条件下。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将每种稀释液 16 µL 转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 EGFR L858R 检测试剂。取等量裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 EGFR L858R 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 17 倍。

简化通路

总 EGFR 信号通路

EGFR 是一种受体酪氨酸激酶，属于 ErbB 家族。EGFR 配体的结合会驱动受体同源二聚化或异源二聚化，从而激活 EGFR 酪氨酸激酶结构域和特定的酪氨酸残基。

磷酸化的酪氨酸残基随后为多种因子提供停靠位点，这些因子可诱导下游多个信号转导通路的激活。

从 EGF 受体传递到细胞核的信号会调控多种生物学功能，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。

导致 EGFR 过表达或过度激活的突变与多种癌症相关，这使 EGFR 成为抗癌治疗的关键靶点。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64EGFRL8PEY

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