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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷、准确地定量酪氨酸 397（Tyr397）位点磷酸化的黏着斑激酶（FAK）（该位点在人、大鼠和鸡中存在，相当于小鼠的 Y428）。FAK 是一种细胞质酪氨酸激酶，调控细胞黏附、迁移、增殖和存活。FAK 是细胞外基质 / 整合素和钙粘蛋白信号的核心调节因子，在细胞黏附、细胞连接、迁移、存活和机械感知中发挥作用。FAK 可被生长因子受体、细胞因子受体和 G 蛋白偶联受体（GPCRs）激活。在多种癌症中，FAK 表达和磷酸化水平的升高与肿瘤细胞黏附、迁移、侵袭能力的增强相关，在组织纤维化中，与成纤维细胞在纤连蛋白上的迁移相关。

工作原理

磷酸化 FAK（Tyr397）检测原理

磷酸化 FAK（Tyr397）检测用于测定 Tyr397 位点磷酸化的 FAK。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 FAK（Tyr397）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 FAK（Tyr397）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 FAK（Tyr397）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 FAK（Tyr397）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 FAK（Tyr397）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

人癌细胞系中磷酸化 FAK（Tyr397）的积累

将人 MCF7 或 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，用过钒酸盐处理细胞 10 分钟（或不处理）。移除培养基后，用 50 µL 补充裂解缓冲液 #3 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物分两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。用磷酸酶抑制剂过钒酸盐处理后，酪氨酸 397 位点的 FAK 磷酸化水平显著升高。FAK 蛋白的总量未受过钒酸盐处理的影响。

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用于监测 FAK 抑制剂药理学特性的 HTRF 磷酸化和总 FAK 检测

将 NIH/3T3 小鼠成纤维细胞或人 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，用浓度递增的 FAK 抑制剂处理细胞 30 分钟。移除培养基后，用 50 µL 补充裂解缓冲液 #3 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物分两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

用 PF-562271 处理后，人 HeLa 细胞和小鼠 NIH/3T3 细胞系中酪氨酸 397 位点的 FAK 磷酸化水平均呈剂量依赖性降低。FAK 蛋白的总量未受过钒酸盐处理的影响。

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用于监测 FAK 抑制剂药理学特性的 HTRF 磷酸化和总 FAK 检测

将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）接种到 24 孔胶原 I 板中（400,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，将细胞置于无血清条件下孵育。第三天，用浓度递增的血管内皮生长因子（VEGF）在无血清培养基中处理细胞 5 分钟（或不处理）。移除培养基后，用 250 µL 补充裂解缓冲液 #3 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物分两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

经 VEGF 刺激的人脐静脉内皮细胞中，酪氨酸 397 位点的 FAK 磷酸化水平呈剂量依赖性升高。VEGF 可调节 FAK 的磷酸化，并在血管生成和细胞生长中发挥作用。

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磷酸化 FAK 细胞的 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将小鼠 NIH/3T3 细胞系接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天，直至达到 90% 的汇合度。然后用 3 mL 补充裂解缓冲液 #3 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF® 磷酸化 FAK 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

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简化通路

FAK 简化通路

这种多结构域蛋白在被细胞表面受体（主要是整合素、细胞因子受体（IL1βR、TNFαR）、生长因子受体（EGFR、VEGFR、PDGFR）和 G 蛋白偶联受体（LPA、蛙皮素））激活后会发生构象变化。细胞质中的非活性 FAK 单体被激活的受体募集到质膜，短暂二聚化后通过酪氨酸 397 的自磷酸化激活。这是 Src 家族激酶的停靠位点，可使其他残基发生磷酸化。完全激活的 FAK 会显示出与 FAK 底物（包括 Grb2、PI3K 和钙粘蛋白）的结合位点。FAK 作为细胞外基质 / 整合素信号的核心调节因子，在黏着斑的组装 / 拆卸调控中是必需的，并在细胞黏附、迁移、存活和机械感知中发挥作用。在钙粘蛋白信号中，对内皮 / 上皮细胞间黏着连接的调控使 FAK 能够在细胞连接、血管通透性和血管生成中发挥作用。FAK 可激活多种底物并调控多个信号通路，如 Rho GTP 酶 / 肌动蛋白（细胞骨架重组 / 细胞迁移）、钙粘蛋白 /β- 连环蛋白（细胞连接稳定性 / 血管通透性）、PI3K/AKT（细胞存活）、MAPK 家族的 ERK 和 JNK（细胞增殖）以及 p53/MDM2（抗凋亡）。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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HTRF FAK P-Y397 KIT - 10K PTS 磷酸化粘附斑激酶（酪氨酸397）检测试剂盒，10000测试

概述

工作原理

磷酸化 FAK（Tyr397）检测原理

磷酸化 FAK（Tyr397）双板检测方案

磷酸化 FAK（Tyr397）单板检测方案

检测验证

人癌细胞系中磷酸化 FAK（Tyr397）的积累

用于监测 FAK 抑制剂药理学特性的 HTRF 磷酸化和总 FAK 检测

用于监测 FAK 抑制剂药理学特性的 HTRF 磷酸化和总 FAK 检测

磷酸化 FAK 细胞的 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

简化通路

FAK 简化通路

规格

其他规格