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HTRF FAK P-Y397 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法可便捷、准确地定量酪氨酸 397（Tyr397）位点磷酸化的黏着斑激酶（FAK）（人、大鼠和鸡的该位点，相当于小鼠的 Y428）。FAK 是一种细胞质酪氨酸激酶，调控细胞黏附、迁移、增殖和存活。它是细胞外基质（ECM）/ 整合素和钙粘蛋白信号通路的核心调节因子，在细胞黏附、细胞连接、迁移、存活和机械感知中发挥作用。FAK 可被生长因子受体、细胞因子受体和 G 蛋白偶联受体（GPCRs）激活。在多种癌症中，FAK 表达和磷酸化水平的升高与肿瘤细胞黏附、迁移、侵袭能力增强相关；在组织纤维化中，与成纤维细胞在纤连蛋白上的迁移相关。

工作原理

磷酸化 FAK（Tyr397）检测原理

磷酸化 FAK（Tyr397）检测用于测量 Tyr397 位点磷酸化的 FAK。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 FAK（Tyr397）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 FAK（Tyr397）HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 FAK（Tyr397）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 FAK（Tyr397）可在单个培养板中完成，该板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

人癌细胞系中磷酸化 FAK（Tyr397）的积累

将人 MCF7 或 HeLa 细胞接种于 96 孔板（100,000 个细胞 / 孔），在含完全培养基的条件下于 37°C、5% CO₂中孵育。次日，用过钒酸盐处理细胞 10 分钟（或不处理）。移除培养基后，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。用磷酸酶抑制剂过钒酸盐处理后，FAK 的酪氨酸 397 位点磷酸化水平显著升高，而 FAK 总蛋白量未受过钒酸盐处理影响。

利用 HTRF 磷酸化和总 FAK 检测监测 FAK 抑制剂的药理学特性

将小鼠 NIH/3T3 成纤维细胞或人 HeLa 细胞接种于 96 孔板（100,000 个细胞 / 孔），在含完全培养基的条件下于 37°C、5% CO₂中孵育。次日，用不同浓度的 FAK 抑制剂处理细胞 30 分钟。移除培养基后，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

用 PF-562271 处理后，人 HeLa 细胞和小鼠 NIH/3T3 细胞中 FAK 的酪氨酸 397 位点磷酸化水平均呈剂量依赖性降低，而 FAK 总蛋白量未受过钒酸盐处理影响。

利用 HTRF 磷酸化和总 FAK 检测监测 FAK 抑制剂的药理学特性

将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）接种于 24 孔胶原 I 包被板（400,000 个细胞 / 孔），在含完全培养基的条件下于 37°C、5% CO₂中孵育。次日，将细胞置于无血清条件下孵育。第三天，在无血清培养基中用不同浓度的血管内皮生长因子（VEGF）处理细胞 5 分钟。移除培养基后，用 250 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

经 VEGF 刺激的 HUVEC 细胞中，FAK 的酪氨酸 397 位点磷酸化水平呈剂量依赖性升高。VEGF 通过调控 FAK 磷酸化，在血管生成和细胞生长中发挥作用。

HTRF 磷酸化 FAK 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将小鼠 NIH/3T3 细胞系接种于 T175 培养瓶的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天，直至达到 90% 汇合度。然后用 3 mL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 FAK 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行对比分析。

简化通路

FAK 简化通路

这种多结构域蛋白在被细胞表面受体激活后会发生构象变化，这些受体主要包括整合素、细胞因子受体（IL1βR、TNFαR）、生长因子受体（EGFR、VEGFR、PDGFR）和 G 蛋白偶联受体（LPA、蛙皮素）。细胞质中的非活性 FAK 单体被激活的受体募集到质膜，发生瞬时二聚化，随后通过酪氨酸 397 位点的自磷酸化被激活。该位点是 Src 家族激酶的停靠位点，可促使其他残基发生磷酸化。完全激活的 FAK 会展示出与多种底物的结合位点，包括 Grb2、PI3K 和钙粘蛋白。FAK 作为细胞外基质 / 整合素信号通路的核心调节因子，在黏着斑的组装 / 拆卸调控中必不可少，并在细胞黏附、迁移、存活和机械感知中发挥作用。在钙粘蛋白信号通路中，通过调控内皮细胞 / 上皮细胞间的黏着连接，FAK 可在细胞连接、血管通透性和血管生成中发挥作用。FAK 能激活多种底物并调控多条信号通路，如 Rho GTPases / 肌动蛋白（细胞骨架重组 / 细胞迁移）、钙粘蛋白 /β- 连环蛋白（细胞连接稳定性 / 血管通透性）、PI3K/AKT（细胞存活）、MAPKs ERK 和 JNK（细胞增殖）以及 p53/MDM2（抗凋亡）。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64FAKPEY

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