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HTRF FGFR1 P-Y653/654 KIT - 50K PTS 成纤维细胞生长因子受体1磷酸化Y653/654测量试剂盒 - 50,000测试

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概述

磷酸化 FGFR1 检测旨在对 FGFR1 的调控进行可靠定量，该调控通过 Tyr653/Tyr654 位点的磷酸化实现，可作为 MAPK 和 PI3K/AKT 通路的读数指标。FGFR1 的突变与多种癌症相关，包括肺癌、乳腺癌、尿路上皮癌和卵巢癌等。

工作原理

磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）检测原理

磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）检测用于测量在 Tyr653/654 位点发生磷酸化的 FGFR1。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的形式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了手段。

磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，之后添加磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持可靠的 HTRF 质量。

检测验证

多种人类癌细胞系中 FGFR 蛋白水平的评估

将不同的人类癌细胞系接种到 T175 培养瓶中的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下培养。然后用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

对每个细胞系的 25μg 总蛋白以及 KG-1 细胞系的 15μg 总蛋白进行总 FGFR1-2-3 和 - 4 蛋白水平分析。将 16μL 标准化样品转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 总 FGFR1-FGFR2-FGFR3 或 FGFR4 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示四种不同 FGFR 受体的表达模式存在差异。其中，FGFR1 在 DMS114 肺癌细胞模型和 KG-1 骨髓性白血病模型中高表达；FGFR2 在 SNU-16 和 Kato-III 胃癌模型中优先表达；FGFR3 在 KMS-11 多发性骨髓瘤细胞系中表达；FGFR4 在 MDA-MD-453 乳腺癌模型和 HuH7 肝癌细胞系中表达。此外，这些结果证实了 HTRF 总 FGFR 试剂盒具有识别特异性。

使用磷酸化（Tyr653/654）和总 FGFR1 试剂盒测量抑制效果

将人类 KG-1 细胞（骨髓性白血病细胞）以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到半区 96 孔培养板中，每孔加入 25μL 完全培养基。然后向细胞中加入 5μL 不同浓度的 FGFR 抑制剂 AZD4547，在 37°C、5% CO₂条件下处理 24 小时。处理后，用 10μL 补充的 4 号裂解缓冲液（4X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

将人类 DMS-114 细胞（肺癌细胞）接种到 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔），孵育过夜。用不同浓度的 AZD4547 处理细胞 24 小时（37°C、5% CO₂），然后用 100ng/ml 的 FGF2 刺激 10 分钟。处理后，用 25μL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16μL 裂解物转移至 384 孔白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）或总 FGFR1 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，结果显示用 AZD4547 处理后，FGFR1 的 Y653/654 磷酸化受到剂量依赖性抑制，而 FGFR1 的表达水平保持不变。

HTRF 磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）检测与蛋白质印迹法的比较

将 KG-1 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养，条件为 37°C、5% CO₂。孵育 72 小时后，用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

简化的 FGFR 信号通路

FGFRs 是酪氨酸激酶受体，通过与 FGF 配体结合而被激活。这种结合会促使受体同源二聚化，进而激活 FGFR 酪氨酸激酶结构域并使特定酪氨酸残基磷酸化。激活的受体可作为多种蛋白质的停靠位点，这些蛋白质会诱导下游多个信号转导通路的激活，包括 RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ 和 STAT 通路。

FRS2α 是与 FGFRs 持续结合的关键衔接蛋白。激活的 FGFR 会使 FRS2 磷酸化，从而招募 GRB2 和 SOS，以激活 RAS 及下游的 RAF 和 MAPK 通路，尤其是 ERK1/2。GRB2 还可通过 GAB1 激活 PI3K，进而使 AKT 磷酸化。不依赖于 FRS2，PLCγ 与激活的 FGFRs 胞内部分结合，通过水解 PIP2 生成 IP3 和 DAG。DAG 激活 PKC 酶，这在一定程度上会增强 MAPK 通路的激活。根据细胞环境的不同，FGFRs 还会激活其他通路，如 STAT 信号通路。

从 FGFRs 传递到细胞核的信号会调控多种生物学功能，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。在多种癌症中，FGFRs 的改变与 FGFRs 的过表达或过度活跃相关，这使得该受体成为抗癌治疗的关键靶点。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白
目标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64FGFR1Y6PEY

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