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HTRF FGFR2 P-Y653/654 KIT - 50K PTS 成纤维细胞生长因子受体磷酸化Y653/654测量试剂盒 - 50,000测试

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概述

磷酸化 FGFR2 检测旨在对 FGFR2 的调节进行可靠定量，其在 Tyr653/Tyr654 位点发生磷酸化，可作为 MAPK 和 pi3/AKT 通路的读数指标。FGFR2 的突变与癌症（乳腺癌、黑色素瘤）以及骨骼发育异常（颅缝早闭综合征）相关。

工作原理
磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）检测原理
磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）检测用于测量在 Tyr653/654 位点发生磷酸化的 FGFR2。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成涉及两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质磷酸化状态的方法。

磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）双板检测方案
双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）可在单个板中进行，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持可靠的 HTRF 质量。

检测验证
多种人类癌细胞系中 FGFR 蛋白水平的评估
将不同的人类癌细胞系接种在 T175 培养瓶中的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下培养。然后在室温下，用 3 mL 补充的 4# 裂解缓冲液（1X）在温和振荡下裂解细胞 30 分钟。

对每个细胞系的 25 µg 总蛋白和 KG-1 细胞系的 15 µg 总蛋白进行总 FGFR1-2-3 和 - 4 蛋白水平分析。将 16 µL 标准化样品转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL 每种 HTRF 总 FGFR1-FGFR2-FGFR3 或 FGFR4 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。结果显示四种不同 FGFR 受体的表达模式存在差异。FGFR1 在 DMS114 肺癌细胞模型和 KG-1 骨髓性白血病模型中高表达，FGFR2 在 SNU-16 和 Kato-III 胃癌模型中优先表达，FGFR3 在 KMS-11 多发性骨髓瘤细胞系中表达，FGFR4 在 MDA-MD-453 乳腺癌模型或 HuH7 肝癌细胞系中表达。此外，这些结果证明了 HTRF 总 FGFR 试剂盒具有识别特异性。

使用磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）和总 FGFR2 试剂盒在 SNU-16 细胞上测量抑制作用
将人类 SNU-16 细胞（胃癌）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在半面积 96 孔培养处理板中，加入 25 µL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下，用 5 µL 不同浓度的 FGFR 抑制剂 AZD4547 处理细胞 6 小时。处理后，在室温下用 10 µL 补充的 4# 裂解缓冲液（4X）在温和振荡下裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔 sv 白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）或总 FGFR2 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，结果显示用 AZD4547 处理后，FGFR2 Y653/654 的磷酸化呈剂量反应性抑制，而 FGFR2 的表达水平保持不变。

使用磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）和总 FGFR2 试剂盒在 Kato-III 细胞上测量抑制作用
将人类 Kato-III 细胞（胃癌）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在半面积 96 孔培养处理板中，加入 25 µL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下，用 5 µL 不同浓度的 FGFR 抑制剂 AZD4547 处理细胞 6 小时。处理后，在室温下用 10 µL 补充的 4# 裂解缓冲液（4X）在温和振荡下裂解细胞 30 分钟。

正如预期的那样，结果显示用 AZD4547 处理后，FGFR2 Y653/654 的磷酸化呈剂量反应性抑制，而 FGFR2 的表达水平保持不变。

使用磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）和总 FGFR2 试剂盒在 NCI-H716 细胞上测量抑制作用
将人类 NCI-H716 细胞（结直肠腺癌）接种在 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔），并孵育过夜。在 37°C、5% CO₂条件下，用不同剂量的 AZD4547 处理细胞 6 小时。处理后，在室温下用 50 µL 补充的 4# 裂解缓冲液（1X）在温和振荡下裂解细胞 30 分钟。

正如预期的那样，结果显示用 AZD4547 处理后，FGFR2 Y653/654 的磷酸化呈剂量反应性抑制，而 FGFR2 的表达水平保持不变。

HTRF 磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）检测与蛋白质印迹法的比较
在 37°C、5% CO₂条件下，将 SNU-16 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养。孵育 72 小时后，在室温下用 3 mL 补充的 4# 裂解缓冲液（1X）在温和振荡下裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 FGFR2（Tyr653/654）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

简化通路
简化的 FGFR 信号通路
FGFRs 是酪氨酸激酶受体，通过与 FGF 配体结合而被激活。这种结合会促使受体同源二聚化，进而激活 FGFR 酪氨酸激酶结构域并使特定酪氨酸残基磷酸化。激活的受体可作为多种蛋白质的停靠位点，这些蛋白质会诱导多个信号转导级联反应的下游激活，包括 RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ 和 STAT 通路。FRS2α 是与 FGFRs 持续结合的关键衔接蛋白。激活的 FGFRs 使 FRS2 磷酸化，从而招募 GRB2 和 SOS 来激活 RAS 以及下游的 RAF 和 MAPK 通路，特别是 ERK1/2。GRB2 还通过 GAB1 激活 PI3K，然后 PI3K 使 AKT 磷酸化。不依赖于 FRS2，PLCγ 与激活的 FGFRs 胞内部分的结合会通过水解 PIP2 产生 IP3 和 DAG。DAG 激活 PKC 酶，这在一定程度上会加强 MAPK 通路的激活。根据细胞环境，FGFRs 还会激活其他通路，如 STAT 信号通路。从 FGFRs 传递到细胞核的信号会调节各种生物学功能，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。多种癌症中 FGFRs 的改变与 FGFRs 的过表达或过度活跃相关，这使得这些受体成为抗癌治疗的关键靶点。

规格

其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
磷酸化
产品类别
试剂盒
样品体积
16 µL
运输条件
干冰运输
目标类别
磷蛋白
目标物种
人类
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
肿瘤学与炎症
罕见疾病
单位规格
50,000 个检测点

没有数据

货号：64FGFR2Y6PEY

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