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HTRF FGFR3 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

Total-FGFR3 细胞检测可监测总 FGFR3，并且能与磷酸化 FGFR3 试剂盒配合用作归一化检测。FGFR3 的突变与多种癌症相关，如膀胱癌、结肠癌或黑色素瘤等。

工作原理

Total-FGFR3 检测原理
Total-FGFR3 检测可定量细胞裂解物中 FGFR3 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。Total-FGFR3 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。这两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 FGFR3 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达的方法。

Total-FGFR3 双板检测方案
双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加 Total-FGFR3 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

Total-FGFR3 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 FGFR3 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证
不同人类癌细胞系中 FGFRs 蛋白水平的评估
将不同的人类癌细胞系接种到 T175 培养瓶中的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂ 条件下培养。然后在室温下，用 3 mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）在温和振荡下裂解细胞 30 分钟。

对每个细胞系的 25 µg 总蛋白以及 KG-1 细胞系的 15 µg 总蛋白进行总 FGFR1 - 2 - 3 和 - 4 蛋白水平分析。将 16 µL 归一化样品转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并添加 4 µL 每种 HTRF 总 FGFR1、FGFR2、FGFR3 或 FGFR4 检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。结果显示四种不同 FGFR 受体的表达模式存在差异。FGFR1 在 DMS114 肺癌细胞模型和 KG - 1 骨髓性白血病模型中高表达，FGFR2 优先在 SNU - 16 和 Kato - III 胃癌模型中表达，FGFR3 在 KMS - 11 多发性骨髓瘤细胞系中表达，FGFR4 在 MDA - MD - 453 乳腺癌模型或 HuH7 肝癌细胞系中表达。此外，这些结果证明了 HTRF Total - FGFR 试剂盒的识别特异性。

使用磷酸化（Tyr647/648）和 Total - FGFR3 试剂盒测量抑制作用
将人类 KMS - 11 细胞（多发性骨髓瘤细胞系）接种到 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔）并孵育过夜。在 37°C、5% CO₂ 条件下，用不同剂量的 AZD4547 处理细胞 6 小时，然后用 200 ng/ml FGF2 刺激 10 分钟。处理后，在室温下用 25 µl 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）在温和振荡下裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并添加 4 µL HTRF 磷酸化 FGFR3（Tyr647/648）或 Total - FGFR3 检测试剂。在室温下 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，结果显示用 AZD4547 处理后，FGFR1 Y647/648 的磷酸化受到剂量依赖性抑制，而 FGFR3 的表达水平保持恒定。

HTRF 总 FGFR3 检测与蛋白质印迹法的比较
将 KMS - 11 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中，于 37°C、5% CO₂ 条件下培养。孵育 72 小时后，用 200 ng/ml FGF2 处理细胞 10 分钟，然后在室温下用 3 mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）在温和振荡下裂解 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF Total - FGFR3 检测试剂。使用等量的裂解物对 HTRF 和蛋白质印迹法进行平行比较。

简化通路
FGFR 信号传导简化通路
FGFRs 是酪氨酸激酶受体，通过与 FGF 配体结合而被激活。这种结合会驱动受体同源二聚化，进而激活 FGFR 酪氨酸激酶结构域，并使特定的酪氨酸残基磷酸化。被激活的受体成为多种蛋白质的停靠位点，这些蛋白质会诱导多个信号转导级联反应的下游激活，包括 RAS - MAPK、PI3K - AKT、PLCγ 和 STAT 通路。

FRS2α 是一种与 FGFRs 持续结合的关键衔接蛋白。被激活的 FGFR 会使 FRS2 磷酸化，从而招募 GRB2 和 SOS 来激活 RAS 以及下游的 RAF 和 MAPK 通路，特别是 ERK1/2。GRB2 还通过 GAB1 激活 PI3K，然后 PI3K 会使 AKT 磷酸化。不依赖于 FRS2，PLCγ 与被激活的 FGFR 胞内部分结合，通过水解 PIP2 产生 IP3 和 DAG。DAG 激活 PKC 酶，这在一定程度上会增强 MAPK 通路的激活。根据细胞环境，FGFRs 还会激活其他通路，如 STAT 信号通路。

从 FGFRs 传递到细胞核的信号会调控多种生物学功能，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。在多种癌症中，FGFRs 的改变与 FGFRs 的过表达或过度活跃相关，这使得这些受体成为抗癌治疗的关键靶点。

规格

其他规格
应用领域
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
总（蛋白）
产品类别
试剂盒
样品体积
16 µL
运输条件
干冰运输
目标类别
磷蛋白
目标物种
人类
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR - FRET）
治疗领域
肿瘤学与炎症
单位规格
50,000 个检测点

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货号：64FGFR3TPEY

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