64FGFR4Y6PEH

概述

磷酸化 FGFR4 检测试剂盒旨在对酪氨酸 642（Tyr642）位点磷酸化的 FGFR4 调控进行可靠定量，可作为 MAPK 和 PI3K/AKT 通路的读数指标。

工作原理

磷酸化 FGFR4（Tyr642）检测原理

磷酸化 FGFR4（Tyr642）检测用于测定 Tyr642 位点磷酸化的 FGFR4。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 FGFR4（Tyr642）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 FGFR4（Tyr642）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 FGFR4（Tyr642）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 FGFR4（Tyr642）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 FGFR4（Tyr642）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

多种人类癌细胞系中 FGFR 蛋白水平的评估

将不同的人类癌细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下用完全培养基培养。然后用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。

对每个细胞系 25 µg 的总蛋白和 KG-1 细胞系 15 µg 的总蛋白的总 FGFR1-2-3 和 FGFR4 蛋白水平进行分析。将 16 µL 归一化样品转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL 各 HTRF 总 FGFR1、FGFR2、FGFR3 或 FGFR4 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示四种不同 FGFR 受体的表达模式存在差异：FGFR1 在 DMS114 肺癌细胞模型和 KG-1 骨髓性白血病模型中高表达；FGFR2 在 SNU-16 和 Kato-III 胃癌模型中优先表达；FGFR3 在 KMS-11 多发性骨髓瘤细胞系中表达；FGFR4 在乳腺癌模型或 HuH7 肝癌细胞系中表达。

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FGFR4 试剂盒在乳腺癌细胞中的验证

人类乳腺癌细胞接种到 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），过夜孵育。用浓度递增的 AZD4547 处理细胞 6 小时（37°C、0% CO₂）。处理后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 FGFR4（Tyr642）或总 FGFR4 检测试剂。室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，结果显示 AZD4547 处理会对 FGFR4 的 Y642 磷酸化产生剂量依赖性抑制，而 FGFR4 的表达水平保持恒定。

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HTRF 磷酸化 FGFR4（Tyr642）检测与蛋白质印迹法的比较

乳腺癌细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、0% CO₂条件下培养。孵育 72 小时后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 FGFR4（Tyr642）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

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简化通路

FGFR 信号传导简化通路

FGFRs 是酪氨酸激酶受体，通过与 FGF 配体结合被激活。这种结合会促使受体同源二聚化，进而激活 FGFR 的酪氨酸激酶结构域并使特定酪氨酸残基磷酸化。激活的受体成为多种蛋白质的停靠位点，这些蛋白质会诱导多个信号转导级联反应的下游激活，包括 RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ 和 STAT 通路。

FRS2α 是与 FGFRs 持续结合的关键衔接蛋白。激活的 FGFR 会磷酸化 FRS2，从而招募 GRB2 和 SOS 来激活 RAS 以及下游的 RAF 和 MAPK 通路（尤其是 ERK1/2）。GRB2 还通过 GAB1 激活 PI3K，进而使 AKT 磷酸化。不依赖于 FRS2，PLCγ 与激活的 FGFRs 胞内部分结合，通过水解 PIP2 产生 IP3 和 DAG。DAG 激活 PKC 酶，这在一定程度上会增强 MAPK 通路的激活。根据细胞环境的不同，FGFRs 还会激活其他通路，如 STAT 信号通路。

从 FGFRs 传递到细胞核的信号会调控多种生物学功能，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。多种癌症中 FGFRs 的异常与 FGFRs 的过表达或过度活跃相关，这使得这些受体成为抗癌治疗的关键靶点。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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HTRF FGFR4 P-Y642 KIT - 10K PTS 磷酸化成纤维细胞生长因子受体4检测试剂盒 – 10000测试点

概述

工作原理

磷酸化 FGFR4（Tyr642）检测原理

磷酸化 FGFR4（Tyr642）双板检测方案

磷酸化 FGFR4（Tyr642）单板检测方案

检测验证

多种人类癌细胞系中 FGFR 蛋白水平的评估

FGFR4 试剂盒在乳腺癌细胞中的验证

HTRF 磷酸化 FGFR4（Tyr642）检测与蛋白质印迹法的比较

简化通路

FGFR 信号传导简化通路

规格

其他规格