HTRF FGFR4 P-Y642 KIT - 50K PTS

概述

磷酸化FGFR4检测旨在对FGFR4的调控进行可靠定量，该调控通过Tyr642位点的磷酸化实现，可作为MAPK和PI3K/AKT通路的读数指标。 工作原理 磷酸化FGFR4（Tyr642）检测原理 磷酸化FGFR4（Tyr642）检测用于测量在Tyr642位点发生磷酸化的FGFR4。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化FGFR4（Tyr642）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。 磷酸化FGFR4细胞检测试剂盒 磷酸化FGFR4（Tyr642）双板检测方案 双板方案包括：先在96孔板中培养细胞，然后裂解细胞，将裂解物转移至384孔小体积检测板，之后再加入磷酸化FGFR4（Tyr642）HTRF检测试剂。此方案能够监测细胞的活力和汇合度。 磷酸化FGFR4细胞检测试剂盒 磷酸化FGFR4（Tyr642）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化FGFR4（Tyr642）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的HTRF质量。 磷酸化FGFR4细胞检测试剂盒 检测验证 多种人类癌细胞系中FGFR蛋白水平的评估 将不同的人类癌细胞系接种到T175培养瓶的完全培养基中，在37°C、5% CO₂条件下培养。然后用3mL补充的#4裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞30分钟。 对每种细胞系的25μg总蛋白以及KG-1细胞系的15μg总蛋白进行总FGFR1-2-3和-4蛋白水平分析。将16μL标准化样品转移至384孔小体积白色微孔板中，并加入4μL各HTRF总FGFR1-FGFR2-FGFR3或FGFR4检测抗体。过夜孵育后记录HTRF信号。结果显示四种不同的FGFR受体存在差异化表达模式。其中，FGFR1在DMS114肺癌细胞模型和KG-1骨髓性白血病模型中高表达；FGFR2在SNU-16和Kato-III胃癌模型中优先表达；FGFR3在KMS-11多发性骨髓瘤细胞系中表达；FGFR4在乳腺癌模型或HuH7肝癌细胞系中表达。 磷酸化FGFR4细胞检测试剂盒 FGFR4试剂盒在乳腺癌细胞上的验证 将人类乳腺癌细胞接种到96孔板中（200,000个细胞/孔），并孵育过夜。用不同浓度的AZD4547处理细胞6小时，培养条件为37°C、0% CO₂。处理后，用50μL补充的#4裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞30分钟。细胞裂解后，将16μL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，并加入4μL HTRF磷酸化FGFR4（Tyr642）或总FGFR4检测试剂。室温过夜孵育后记录HTRF信号。 正如预期，结果显示经AZD4547处理后，FGFR4 Y642的磷酸化受到剂量依赖性抑制，而FGFR4的表达水平保持不变。 磷酸化FGFR4细胞检测试剂盒 HTRF磷酸化FGFR4（Tyr642）检测与蛋白质印迹法的比较 在T175培养瓶的完全培养基中培养乳腺癌细胞，培养条件为37°C、0% CO₂。孵育72小时后，用3mL补充的#4裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞30分钟。 使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将16μL各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入4μL HTRF磷酸化FGFR4（Tyr642）检测试剂。使用等量的裂解物进行HTRF与蛋白质印迹法的平行比较。 蛋白质印迹法与HTRF的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF检测的灵敏度是蛋白质印迹法的16倍。 磷酸化FGFR4细胞检测试剂盒 简化通路 简化的FGFR信号通路 FGFRs是酪氨酸激酶受体，通过与FGF配体结合而被激活。这种结合会促使受体同源二聚化，进而激活FGFR酪氨酸激酶结构域并使特定的酪氨酸残基磷酸化。激活的受体可作为多种蛋白质的停靠位点，这些蛋白质会诱导下游多个信号转导级联的激活，包括RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ和STAT通路。 FRS2α是与FGFRs持续结合的关键衔接蛋白。激活的FGFR会使FRS2磷酸化，从而招募GRB2和SOS来激活RAS以及下游的RAF和MAPK通路，特别是ERK1/2。GRB2还可通过GAB1激活PI3K，进而使AKT磷酸化。不依赖于FRS2，PLCγ与激活的FGFRs胞内部分结合，通过水解PIP2生成IP3和DAG。DAG激活PKC酶，这在一定程度上会增强MAPK通路的激活。根据细胞环境的不同，FGFRs还会激活其他通路，如STAT信号通路。 从FGFRs传递至细胞核的信号会调控多种生物学功能，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。在多种癌症中，FGFRs的改变与FGFRs的过表达或过度活跃相关，这使得该受体成为抗癌治疗的关键靶点。 磷酸化FGFR4细胞检测试剂盒规格

其他规格 应用领域 细胞信号传导 品牌 HTRF 检测方式 HTRF 分子修饰 磷酸化 产品类别 试剂盒 样品体积 16μL 运输条件 干冰运输 目标类别 磷酸化蛋白质 目标物种 人类 技术 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域 肿瘤学与炎症 单位规格 50,000个检测点