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HTRF C-SRC TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 c-Src 细胞检测可监测总 c-Src 的水平，且可作为磷酸化 c-Src 试剂盒的归一化检测方法。该蛋白属于 Src 激酶家族，与其他 10 个家族成员具有高度的序列同源性。它是一种膜相关的非受体酪氨酸激酶，其 Tyr419 位点的自磷酸化标志着该激酶的完全激活。在许多人类癌症中，c-Src 激酶存在过表达和高度激活的现象，这使其成为癌症治疗中一个极具潜力的靶点。

工作原理

总 c-Src 检测原理

总 c-Src 检测用于定量细胞裂解物中 c-Src 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测是完全基于微孔板的，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 c-Src 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 c-Src 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用免洗形式，为评估蛋白质表达提供了便利手段。

总 c-Src 双板检测方案

双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入总 c-Src HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 c-Src 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 c-Src 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，且无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

通过对人 HEK293 细胞的 siRNA 实验验证 HTRF 检测对 c-Src 的特异性

将人 HEK293 胚胎肾细胞接种并培养 24 小时，然后用 c-Src siRNA 或阴性对照 siRNA 转染细胞，接着用不同浓度的 H₂O₂处理细胞，之后移除培养基并进行裂解。将裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入试剂盒试剂。与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，用 c-Src siRNA 处理的细胞其 HTRF 信号大幅降低（约 75%），这表明该试剂盒对 c-Src 具有特异性，且不会与其他 Src 家族成员发生交叉反应。

在 A431 癌细胞上使用总 c-Src 检测对比 HTRF 与蛋白质印迹法（WB）

将人 A431 癌细胞接种到 T175 培养瓶中，培养至汇合度达到 80%。细胞裂解后，通过离心收集可溶性上清液，在补充的裂解缓冲液中进行系列稀释，然后转移至 384 孔低体积白色微孔板，最后加入 HTRF 总检测试剂。使用等量的裂解物对蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行比较，结果显示 HTRF 总 c-Src 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

博舒替尼对 HEK293 细胞中 c-Src 活性的抑制作用

将 HEK293 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的博舒替尼处理细胞 30 分钟，然后用 20 mM H₂O₂刺激 10 分钟，之后移除培养基，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

使用 H₂O₂激活人 A431 表皮样癌细胞中的 c-Src

将 A431 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的 H₂O₂处理细胞 10 分钟，之后移除培养基，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

在其他人类癌细胞系上的验证

在经培养处理的 96 孔板中接种人 HepG2 肝癌细胞、人 HeLa 宫颈癌细胞和人 MCF-7 乳腺癌细胞。孵育后，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

简化通路

c-Src 简化通路

c-Src 是一种膜相关的非受体蛋白酪氨酸激酶，在所有细胞类型中均有表达。当 Tyr530 位点被磷酸化时，该激酶处于失活状态。Tyr530 位点去磷酸化后，Tyr419 位点发生自磷酸化，这是其完全激活的标志。c-Src 主要由受体酪氨酸激酶（RTKs）、整合素和活性氧（ROS）激活，是一种关键的信号中介分子，可调控众多通路，如 AKT、MAPKs、STATs 和 NF-κB 等。它参与调节细胞增殖、分化、存活、形态、黏附和迁移等过程。因此，对 Src 活性的精确调控对正常细胞生长至关重要。这种源于原癌基因的蛋白在许多人类癌症（如乳腺癌、结肠癌和胰腺癌）中存在过表达和高度激活的情况，使其成为癌症治疗的一个极具潜力的靶点。

规格参数

项目	详情
应用领域	细胞信号传导
品牌	HTRF
检测方式	HTRF
分子修饰	总蛋白
产品类别	试剂盒
样品体积	16 µL
运输条件	干冰运输
目标类别	磷酸化蛋白
目标物种	人、小鼠
技术原理	时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域	肿瘤学与炎症
单位规格	50,000 个检测点

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货号：64NSRPEY

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