64MK4PEY

概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷、准确地定量 Ser257 位点磷酸化的 MKK4（丝裂原活化蛋白激酶激酶 4）。MKK4 的丝氨酸 257 位点磷酸化由多种 MKK 激酶（如 TAK1、Tpl2 或 ASK1）诱导，以响应细胞应激和促炎细胞因子。

工作原理

磷酸化 MKK4（Ser257）检测原理

磷酸化 MKK4（Ser257）检测用于测量在 Ser257 位点发生磷酸化的 MKK4。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了途径。

磷酸化 MKK4（Ser257）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，之后加入磷酸化 MKK4（Ser257）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 MKK4（Ser257）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 MKK4（Ser257）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

茴香霉素对维甲酸（RA）分化的 SH-SHY5Y 细胞的剂量反应

将人 SH-SY5Y 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，将细胞在含有 10µM RA 的分化培养基中避光孵育 1 周。请注意，由于 RA 稳定性较差，含新鲜 RA 的细胞培养基需每天更换。分化完成后，用不同浓度的茴香霉素刺激 SH-SY5Y 细胞 45 分钟。然后移除培养基，加入 50µL 补充的 1X 裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，取 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如其他文献所述，茴香霉素诱导了 MKK4 在 Ser257 位点的剂量依赖性磷酸化，而在相同实验条件下总 MKK4 略有减少。

H₂O₂对维甲酸（RA）分化的 SH-SHY5Y 细胞的刺激作用

将人 SH-SY5Y 细胞以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到 6 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，将细胞在含有 10µM RA 的分化培养基中避光孵育 1 周。请注意，由于 RA 稳定性较差，含新鲜 RA 的细胞培养基需每天更换。分化完成后，用 0.5mM H₂O₂刺激 SH-SHY5Y 细胞 1 小时。然后移除培养基，加入 500µL 补充的 1X 裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，取 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

H₂O₂诱导了 MKK4 在 Ser257 残基的磷酸化，而在相同实验条件下 MKK4 的表达水平几乎保持稳定。

茴香霉素对 HepG2 细胞的剂量反应及与蛋白质印迹法的相关性

将人 HepG2 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，用不同浓度的茴香霉素刺激细胞 45 分钟。然后移除培养基，加入 50µL 补充的 1X 裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，取 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。在平行实验中，用相同量的裂解物进行蛋白质印迹分析。

如图所示，HTRF 和蛋白质印迹法均显示 MKK4 磷酸化增加，同时 MKK4 表达减少。

HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 HepG2 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。然后用山梨糖醇（1M）刺激细胞 30 分钟后进行裂解。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）检测时，每孔 310 个细胞就足以检测到信号，而使用依赖化学发光信号的蛋白质印迹法则需要 5,000 个细胞。这些结果表明，HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

简化通路

MKK4 检测的简化通路

MKK4（丝裂原活化激酶激酶 4）是 MAP 激酶激酶家族的成员，在不同的 MKKK（如 TAK1 或 ASK1）激活后，通过 Ser257 位点的磷酸化而被激活，以响应诸如 GPCR 激活、生长因子、细胞应激或炎症细胞因子等刺激。反过来，活化的 MKK4 磷酸化 JNK 或 p38，以激活 c-jun、p53 或 ATF2，并通过调节基因转录诱导炎症、细胞存活 / 凋亡、增殖或分化。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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HTRF MKK4 P-S257 KIT - 50K PTS

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