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HTRF (H) FLT3 P-Y842 KIT - 50K PTS

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概述

HTRF 人 FLT3（Fms 样酪氨酸激酶 3，又称 FLK2）磷酸化 Tyr 842 检测试剂盒可监测多种细胞中野生型 FLT3（FLT3 WT）和 / 或内部串联重复（ITD）FLT3 突变体在 Tyr 842 位点的磷酸化情况。FLT3 是一种 III 类受体酪氨酸激酶，在免疫细胞中表达，通过其配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后，FLT3 受体发生二聚化并激活多种通路，包括磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）和 MAPK 通路，从而促进免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路的失调可能导致免疫细胞的无序增殖、未成熟化以及致癌表型。FLT3 是急性髓系白血病（AML）中最常见的突变基因。FLT3 基因的突变会导致受体激酶活性的持续激活，或破坏受体的自身抑制活性。ITD FLT3 突变体因其在 AML 中的作用而广为人知。因此，FLT3 突变体已成为制药行业的重要药物靶点。

工作原理
磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测原理
磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测用于测量在酪氨酸 842 位点发生磷酸化的 FLT3。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测使用两种抗体，一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

人磷酸化 FLT3 - Tyr842 检测试剂盒
磷酸化 FLT3（Tyr 842）双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，之后再加入磷酸化 FLT3 Tyr842 HTRF 检测试剂。

该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

人磷酸化 FLT3 - Tyr842 检测试剂盒
磷酸化 FLT3（Tyr 842）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 FLT3 Tyr842 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持可靠的 HTRF 质量。

人磷酸化 FLT3 - Tyr842 检测试剂盒
检测验证
FLT3 - L 处理对磷酸化 FLT3（Tyr 842）的药理学调控
将 FLT3 稳定表达的 Ba/F3 细胞和 THP1 细胞分别以 250,000 个 / 孔和 500,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的 FLT3 配体（FLT3 - L）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 15 分钟。然后用 50 µl 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 589/591、磷酸化 FLT3 Tyr 842 或总 FLT3 检测试剂。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。（注：对于磷酸化 Tyr 842 检测，过夜孵育可增强信号）

正如预期的那样，FLT3 - L 诱导 FLT3 二聚化，同时酪氨酸 589、591 和 842 位点的磷酸化水平呈剂量依赖性增加，而对 FLT3 总蛋白的表达水平无影响。

人磷酸化 FLT3 - Tyr842 检测试剂盒
人磷酸化 FLT3 - Tyr842 检测试剂盒
使用 HTRF 磷酸化 FLT3（Tyr 842）和总 FLT3 检测试剂盒检测抑制剂对 BaF3 ITD 细胞和 MV4 - 11 细胞的作用
将 FLT3 稳定表达的 Ba/F3 细胞以 250,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 115 ng/mL 的 FLT3 - L（EC80）以及不同浓度的奎扎替尼（Quizartinib）和米哚妥林（Midaustaurin）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。然后移除培养基，用 50 µl 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 842 和总 FLT3 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

奎扎替尼和米哚妥林的 IC50 分别为 0.5 ng/mL 和 11 ng/mL。

这两种化合物均未影响 FLT3 总蛋白的表达水平。

人磷酸化 FLT3 - Tyr842 检测试剂盒
磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测的特异性
将 FLT3 稳定表达的 Ba/F3 细胞以 250,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。在存在或不存在 1µM 围绕酪氨酸 842 磷酸化位点的磷酸化肽段的情况下，用高浓度的 FLT3 配体（FLT3 - L）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 15 分钟。然后用 50 µl 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 842 检测试剂。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，磷酸化肽段与 FLT3 受体的磷酸化位点竞争，导致信号完全消失。这证明了该检测的特异性。

人磷酸化 FLT3 - Tyr842 检测试剂盒
HTRF 磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测与蛋白质印迹法的比较
将 FLT3 稳定表达的 Ba/F3 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中，于 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。用 0.5 µg/mL 的 FLT3 配体在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 15 分钟。移除培养基后，用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1x）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的 4 号裂解缓冲液（1x）对细胞裂解物进行系列稀释，然后将 16µL 纯样品和各稀释液转移至 384 孔小体积微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 842 检测试剂。过夜孵育后记录信号。

将等量的裂解物上样到凝胶中，进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 842 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 16 倍。

人磷酸化 FLT3 - Tyr842 检测试剂盒
简化通路
FLT3 受体信号通路
FLT3 是一种 III 类受体酪氨酸激酶，在免疫细胞中表达，通过其配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后，FLT3 受体发生二聚化并激活多种通路，包括磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）和 MAPK 通路，从而促进免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路的失调可能导致无序增殖、未成熟免疫细胞和致癌表型。FLT3 基因的突变会导致受体激酶活性的持续激活，或破坏受体的自身抑制活性。ITD FLT3 突变体不需要 FLT3L 即可激活其下游通路。FLT3 因其在白血病（尤其是急性髓系白血病，AML）发生发展中的作用而广为人知。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白
目标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR - FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64FLT3Y2PEY

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