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HTRF FOXO1 P-S256 KIT - 500 PTS

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概述

磷酸化 FoxO1（Ser256）检测旨在对丝氨酸 256（Ser256）位点磷酸化的 FoxO1 调控进行稳健定量，以此作为其失活的指标。FoxO1 是叉头转录因子 FOXO 亚家族的成员，在胰岛素敏感组织中高表达，调控糖 / 脂代谢和应激抵抗。它还通过抑制细胞增殖发挥肿瘤抑制因子的作用。FoxO1 的失调在糖尿病、非酒精性脂肪肝（NAFLD）等代谢疾病的发生发展中起关键作用，其功能异常还与多种癌症相关。

工作原理

磷酸化 FoxO1（Ser251）检测原理

磷酸化 FoxO1（Ser251）检测用于测定丝氨酸 251（Ser251）位点磷酸化的 FoxO1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 FoxO1（Ser251）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 FoxO1（Ser251）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 FoxO1（Ser251）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 FoxO1（Ser251）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 FoxO1（Ser251）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

胰岛素处理后的 FoxO1 失活

将人 HepG2 细胞和小鼠 C2C12 细胞接种并在高糖培养基中培养，随后用浓度递增的胰岛素处理 1 小时。裂解后，将细胞裂解物多次转移至小体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化 FoxO1 或总 FoxO1 检测抗体。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。在两种细胞系中，胰岛素处理均诱导 FoxO1 在 Ser256 位点发生磷酸化（失活），而其表达水平保持稳定。

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细胞因子和氧化应激对 HepG2 细胞中 FoxO1 的激活作用

将人 HepG2 细胞接种并在高糖培养基中培养，然后用肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）/ 白细胞介素 - 1β（IL-1β）/ 白细胞介素 - 6（IL-6）混合物或过氧化氢（H₂O₂）处理。裂解后，将可溶性细胞裂解物多次转移至小体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化 FoxO1 或总 FoxO1 检测抗体。结果表明，促炎细胞因子和活性氧（ROS）通过诱导 HepG2 细胞系中 FoxO1 的去磷酸化（激活）来驱动代谢失调，而其表达水平保持稳定。

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使用 PI3K 抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin）激活胰腺 β 细胞中的 FoxO1

将小鼠胰腺 β 细胞系 Min-6 接种并在高糖培养基中培养 3 天，随后用浓度递增的渥曼青霉素处理 1 小时。裂解后，将细胞裂解物多次转移至小体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化 FoxO1 或总 FoxO1 检测抗体。结果显示，渥曼青霉素可抑制 PI3K/AKT 通路，导致 Min-6 细胞系中 FoxO1 去磷酸化（激活）。FoxO1 的表达水平保持稳定，表明该化合物对细胞无细胞毒性作用。

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在宫颈癌 HeLa 细胞系中使用胰岛素样生长因子 - 1（IGF-1）失活 FoxO1

将人 HeLa 细胞接种并在完全培养基中培养 24 小时，然后在无血清培养基中孵育过夜，再用浓度递增的 IGF-1 处理。裂解后，将细胞裂解物多次转移至小体积白色微孔板中，然后加入磷酸化或总 FoxO1 抗体。结果显示，生长因子 IGF-1 通过诱导 FoxO1 在 Ser256 位点磷酸化使其失活，从而促进肿瘤细胞增殖，且其表达水平保持稳定。

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人 HEK293 细胞中 HTRF 磷酸化及总 FoxO1 检测与蛋白质印迹法（WB）的比较

将 HEK293 细胞接种并在完全培养基中培养至汇合度达到 90%。裂解后，通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释，转移至小体积白色微孔板中，然后加入 HTRF 磷酸化或总检测抗体。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较。结果显示，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。使用 HTRF 总 FoxO1 试剂盒时，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

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简化通路

FoxO1 简化通路

胰岛素 / 胰岛素样生长因子 - 1（IGF-1）信号通路激活 AKT 激酶，进而使 FoxO1 在 Ser256 位点磷酸化，导致其在细胞质中滞留并抑制其转录活性。在这种情况下，肝糖原生成受到抑制，脂肪生成增加，细胞增殖。相反，去磷酸化形式的 FoxO1 可转移至细胞核，诱导参与糖生成、脂解、抑制脂肪生成、应激抵抗、凋亡、自噬和炎症的基因转录。在促炎细胞因子、氧化应激、禁食和运动等条件下，应激蛋白 JNK 和 p38 可激活 FoxO1。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）/ 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64FOXPEG

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