当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF (H) GSPT1 TOTAL KIT - 10K PTS

HTRF (H) GSPT1 TOTAL KIT - 10K PTS

分享给好友

rvty_ls_sds_64GSPT1TPEH_US rvty_ls_sds_64GSPT1TPEH_UK rvty_ls_sds_64GSPT1TPEH_SPA rvty_ls_sds_64GSPT1TPEH_ITA rvty_ls_sds_64GSPT1TPEH_ELL rvty_ls_sds_64GSPT1TPEH_DEU rvty_ls_sds_64GSPT1TPEH_FRA

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

GSPT1（G1 至 S 期转换 1）蛋白主要以其在蛋白质合成终止中的作用而闻名，如今已成为药物研发中的热门靶点。在靶向蛋白降解领域尤其如此，因为在某些癌症（包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌以及急性髓系淋巴瘤）中已观察到 GSPT1 水平升高。此外，GSPT1 可能会增强癌细胞的化疗耐药性。其过表达会降低癌细胞对抗癌药物的敏感性，使其成为克服耐药性的潜在治疗靶点。

工作原理

总 GSPT1 检测原理

HTRF 总 GSPT1 检测可定量细胞裂解物中 GSPT1 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 GSPT1 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 GSPT1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中 GSPT1 的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估该蛋白的表达水平。

human-total-gspt1-detection-kit-1.svg

总 GSPT1 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入总 GSPT1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

human-total-gspt1-detection-kit

人总 GSPT1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 GSPT1 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

human-total-gspt1-detection-kit

检测验证

使用分子胶在 HAP-1 细胞中对 HTRF 总 GSPT1 的调控

将 HAP-1 野生型或脑衰蛋白（Cereblon）敲除细胞系以 30,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，用浓度递增的分子胶 CC-885、CC-90009 或 SJ6986（据报道可诱导 GSPT1 降解）处理细胞。

处理 24 小时后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4。随后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF GSPT1 检测抗体。另外，将 4 µL 裂解物（补充 12 µL 稀释液 #8）也转移至微孔板中，使用 α- 微管蛋白管家蛋白细胞检测试剂盒（64ATUBPET/G/H）检测 α- 微管蛋白水平。室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

这三种分子胶在 HAP-1 野生型细胞中触发了 GSPT1 的剂量依赖性降低，而在 HAP-1 脑衰蛋白敲除细胞中，GSPT1 水平未受到显著调控。此外，α- 微管蛋白的表达水平保持不变。与文献一致，我们的结果表明，CC-885、CC-90009 以及 SJ6986 诱导的 GSPT1 降解依赖于脑衰蛋白。

human-total-gspt1-detection-kit

使用分子胶在人非小细胞肺癌细胞 NCI-H358 中对 HTRF 总 GSPT1 的调控

将人非小细胞肺癌细胞 NCI-H358 以 30,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用浓度递增的分子胶 MRT-2359 处理细胞 4 小时或 24 小时。在添加 MRT-2359 前 1 小时，加入或不加入 1 µM 蛋白酶体抑制剂环氧霉素。

处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4。然后将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF GSPT1 检测抗体。另外，将 4 µL 裂解物（补充 12 µL 稀释液 #8）也转移至微孔板中，使用 α- 微管蛋白管家蛋白细胞检测试剂盒（64ATUBPEG）检测 α- 微管蛋白水平。室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

分子胶 MRT-2359 诱导 GSPT1 蛋白呈剂量依赖性降低，处理 4 小时和 24 小时后的降解浓度 50%（DC50*）分别为 153 nM 和 93 nM。此外，环氧霉素可阻止 MRT-2359 诱导的 GSPT1 降解，这清楚地表明泛素 - 蛋白酶体系统参与了 MRT-2359 介导的 GSPT1 降解。

*DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白发生降解时的浓度。

human-total-gspt1-detection-kit

使用 siRNA 验证 HTRF 总 GSPT1 检测的特异性

将 HEK293 细胞以 10,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后用针对 GSPT1 或 GSPT2 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 GSPT1 检测抗体。室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染 GSPT1 siRNA 的细胞信号降低了 70%。而转染 GSPT2 siRNA 的细胞未观察到信号降低。在相同实验条件下，未观察到细胞毒性效应，这可通过 ATPlite™检测测得的 ATP 水平得到证实（数据未显示）。这些结果证明了 HTRF 总 GSPT1 检测试剂盒的检测特异性。

human-total-gspt1-detection-kit

HTRF 与蛋白质印迹法在总 GSPT1 检测灵敏度上的比较

将 HEK293 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。

移除培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。

使用补充的 1X 裂解缓冲液 #4 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 纯样品和各稀释液转移至 384 孔小体积微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 GSPT1 检测抗体。室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

将等量的裂解物上样到凝胶中，以进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 GSPT1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 256 倍。

human-total-gspt1-detection-kit

简化通路

GSPT1 信号通路

当核糖体被招募到 mRNA 的 5' 端时，翻译启动。eIF4E 结合蛋白（如 4EBP1）通过与 eIF4E 结合并阻止翻译机制的招募来抑制翻译。mTOR 对 4EBP1 的过度磷酸化会消除其与 eIF4E 的结合活性，从而促进翻译。

GSPT1 也称为真核释放因子 3a（eRF3a），作为一种小 GTP 酶发挥作用，介导终止密码子的识别。

GSPT1 通过其 C 端与另一种真核释放因子 eRF1 相互作用，形成翻译终止复合物的一部分，当终止密码子进入核糖体的 A 位点时，促使蛋白质解离。

human-total-gspt1-detection-kit

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

没有数据

货号：64GSPT1TPEH

一键复制

参考价格 ¥ 172916.60

产品规格

请咨询￥172916.60

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价