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HTRF (H/M) HDAC4 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过调控组蛋白的乙酰化状态来调节染色质重塑及后续的基因转录。组蛋白去乙酰化会诱导染色质形成浓缩构象，进而抑制基因转录，而这一过程参与了多种生理活动。

重要的是，在多种脑部疾病中，HDACs 存在失调情况，这与自闭症、阿尔茨海默病、抑郁症等疾病的发病机制相关。这表明 HDACs 可能是治疗脑部疾病的潜在靶点。

在 II 类 HDACs 中，HDAC4 是缺血性脑卒中治疗的特定靶点。它通过影响神经元死亡、血管生成和神经发生，在缺血性脑卒中的发病机制以及卒中后的恢复过程中发挥关键作用。

表观遗传通路决定了人类癌症中具有生物学意义的亚群。EZH2 激活和 HDAC4 激活分别与生长因子信号传导和炎症相关，代表了癌细胞的两种不同状态。这一认知或许能帮助我们确定乳腺癌和间充质胶质母细胞瘤中可靶向的驱动因子。

工作原理

总 HDAC4 检测原理

总 HDAC4 检测可对细胞裂解物中 HDAC4 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 HDAC4 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 HDAC4 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中蛋白质的浓度直接相关，并且提供了一种在无需洗涤的检测格式中评估蛋白质表达的方法。

人 - 鼠总 HDAC4 检测试剂盒

总 HDAC4 双板检测方案：双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 HDAC4 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。
总 HDAC4 单板检测方案：使用 HTRF 试剂检测总 HDAC4 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在 MOLT-4 细胞上对磷酸化 HDAC4（Ser246）和总 HDAC4 进行抑制剂表征

将 MOLT-4 细胞（永生化的人急性 T 淋巴细胞白血病细胞）以 300,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中。在 37°C、5% CO₂条件下，用不同浓度的毛喉素（Forskolin）或 H-1152 处理 2 小时后，向每个孔中加入 10μL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16μL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 总 HDAC4 或磷酸化 HDAC4（Ser246）检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

毛喉素是一种可渗透细胞的化合物，能直接激活腺苷酸环化酶（该酶可产生环磷酸腺苷（cAMP）），从而使细胞内 cAMP 水平升高。cAMP 是一种重要的第二信使，参与许多信号转导通路，包括蛋白激酶 A（PKA）的激活。已有研究表明，经毛喉素处理的细胞中磷酸化 HDAC4 蛋白的表达水平会降低。

H-1152 被描述为一种可渗透膜的钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（CaMKII）抑制剂，其半数抑制浓度（IC50）约为 180nM。

正如预期的那样，结果显示用毛喉素和 H-1152 处理后，Ser246 位点的 HDAC4 磷酸化受到明显的剂量依赖性抑制，而 HDAC4 蛋白的表达水平保持不变。

人 - 鼠总 HDAC4 检测试剂盒

利用基因沉默（小干扰 RNA，SiRNA）验证 HTRF 总 HDAC4 检测的特异性和选择性：在 96 孔板中（每孔 40,000 个细胞，150μL 体系），用 2μM 的 SMARTPool Accell 小干扰 RNA（Horizon 公司）处理 MOLT-4 细胞，其中小干扰 RNA 分别特异性靶向 HDAC4（#E-003497-00-0020）和 HDAC5（#E-003498-00-0020），并以非靶向小干扰 RNA（#D-001910-10-05）作为对照，处理 96 小时。通过离心（1400 转 / 分钟，8 分钟）去除培养基后，用 50μL 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞，然后将 16μL 裂解物转移到小体积白色微孔板中，再加入 4μL 预混合的 HTRF 总 HDAC4 检测抗体。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

用 HDAC4 小干扰 RNA 处理细胞后，与转染非靶向小干扰 RNA 的细胞相比，HDAC4 显著下调，信号降低 76%。

尽管 IIa 类蛋白之间具有高度同源性，但用 HDAC5 小干扰 RNA 处理的细胞未观察到信号降低，这证明了该试剂盒的特异性。

在多种人源和鼠源细胞系上的验证

贴壁细胞：将人源贴壁细胞系（宫颈癌细胞系 HELA、肾细胞系 HEK293）和鼠源细胞系 NIH3T3 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。去除培养基后，用 50μL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。
悬浮免疫细胞：将人源悬浮免疫细胞系（急性白血病细胞系 MOLT-4、JURKAT 和 THP-1）以 30μL 体系、150,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后用 10μL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

使用 HTRF 总 HDAC4 试剂盒评估总 HDAC4 蛋白的表达水平。简要步骤为：将 16μL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4μL 预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在悬浮和贴壁细胞系中，总 HDAC4 蛋白都能被良好检测到，且表达水平各不相同。对于特定的细胞模型，必须优化细胞密度，使其处于试剂盒的动态范围内。

HTRF 总 HDAC4 检测能有效检测各种表达不同水平 HDAC4 蛋白的人源细胞模型以及鼠源模型（如 NI3T3 细胞系）中的内源性 HDAC4 蛋白。

HTRF 总 HDAC4 检测与蛋白质印迹法的比较

在 T175 培养瓶中，用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养 MOLT-4 细胞。孵育 24 小时后，用 3mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4μL 总 HDAC4 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

平行比较结果表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

HDAC4 信号通路

HDAC4 根据其磷酸化状态在细胞核和细胞质之间动态穿梭。

响应应激信号时，包括蛋白激酶 C（PKC）、蛋白激酶 D（PKD）和钙 / 钙调蛋白依赖性激酶（CaMK）在内的激酶会直接磷酸化 HDAC4，促使其从细胞核输出到细胞质。磷酸化的 HDAC4 与 14-3-3 蛋白结合并滞留于细胞质中。细胞质中的 HDAC4 可能具有蛋白质去乙酰化酶活性。压迫刺激会增强 PP2A 的活性，导致 HDAC4 去磷酸化，随后 HDAC4 与 14-3-3 蛋白分离并重新定位到细胞核，从而抑制转录因子。

Runx2 编码基质金属蛋白酶（MMPs）的 M10 肽酶家族成员。该家族蛋白参与正常生理过程（如胚胎发育、生殖和组织重塑）以及疾病过程（如关节炎和转移）中细胞外基质的分解。

MEF2 是一类在肌肉细胞分化和凋亡中起重要作用的转录因子。

此外，HDAC4 会与 STAT1 相互作用并对其去乙酰化，从而促进 STAT1 的磷酸化和激活。激活后的 STAT1 转移到细胞核中诱导基因表达，进而引发炎症和凋亡，并抑制自噬。

规格

其他规格
- 应用：细胞信号传导
- 品牌：HTRF
- 检测方式：HTRF
- 兼容裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
- 分子修饰：总（蛋白）
- 产品类别：试剂盒
- 样品体积：16μL
- 运输条件：干冰运输
- 目标类别：磷蛋白
- 目标物种：人、鼠
- 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
- 单位规格：500 个检测点

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货号：64HDAC4TPEY

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