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HTRF (H/M) HDAC5 P-S259 KIT - 50K PTS

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概述

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过调控组蛋白的乙酰化状态来调节染色质重塑及后续的基因转录。组蛋白去乙酰化会诱导染色质形成浓缩构象，进而抑制基因转录，这一过程参与多种生理活动。

HDAC5 属于 IIa 类组蛋白去乙酰化酶，该家族还包括 HDAC4、HDAC7 和 HDAC9。它在调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡和代谢过程中发挥关键作用。

工作原理

磷酸化 HDAC5（Ser259）检测原理

HTRF 磷酸化 HDAC5（Ser259）检测用于测量在 Ser259 位点发生磷酸化的 HDAC5。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 HDAC5（Ser259）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

人 - 鼠磷酸化 HDAC5 检测试剂盒

磷酸化 HDAC5（Ser259）双板检测方案：双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，之后再加入磷酸化 HDAC5（Ser259）HTRF 检测试剂。此方案能够监测细胞的活力和汇合度。
磷酸化 HDAC5（Ser259）单板检测方案：使用 HTRF 试剂检测磷酸化 HDAC5（Ser259）可在单个培养板中完成，该培养板用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在 THP1 细胞上对 HDAC5 Ser259 磷酸化的抑制作用

将 THP1 人细胞（急性单核细胞白血病细胞）以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。在完全细胞培养基中，用不同浓度的星形孢菌素（激酶抑制剂）或福司柯林（腺苷酸环化酶激活剂）在 37°C、5% CO₂条件下处理 2 小时。处理后，向每个孔中加入 10µl 补充的 4X 裂解缓冲液 #4，然后在室温下轻轻振荡 30 分钟（按照悬浮细胞方案操作）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 HDAC5（Ser259）或总 HDAC5 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。注意，预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内进行（数据未显示）。

正如预期的那样，我们的结果显示，通过两种不同机制可触发 Ser259 位点的磷酸化 HDAC5 出现剂量依赖性抑制：①星形孢菌素通过抑制 CAMKII 激酶发挥作用；②福司柯林激活 cAMP 通路，导致 PKD 抑制，进而使 Ser259 位点的磷酸化 HDAC5 减少。使用这两种化合物处理时，总 HDAC5 蛋白的表达水平几乎保持不变。

使用 siRNA 对 HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测的特异性验证

将 THP1 细胞以 300,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，然后用 5µM 的针对 HDAC5 或其他 IIa 类家族成员（HDAC4、HDAC7、HDAC9）的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 24 小时后，用补充的 4X 裂解缓冲液 #4 裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测抗体（按照悬浮细胞方案操作）。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

用特异性 HDAC5 siRNA 转染细胞后，与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，信号降低了 77%，而使用针对 HDAC4、HDAC7 或 HDAC9 的 siRNA 时未观察到信号降低。

综上所述，这些数据表明 HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测具有特异性，不会与其他 IIa 类 HDAC 家族成员发生交叉反应（HDAC4 与 HDAC5 的序列同源性超过 60%）。

siRNA 产品目录参考（Horizon Discovery 公司）：Accell 人 HDAC4 siRNA #E-003497-00-0050；Accell 人 HDAC5 siRNA #E-003498-00-0050；Accell 人 HDAC7 siRNA #E-009330-00-0050；Accell 人 HDAC9 siRNA #E-005241-00-0050

在多种人源和鼠源细胞系上的验证

将贴壁细胞系 HEK293、HEK293T（人胚胎肾细胞）和 NIH3T3（小鼠成纤维细胞）接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用 100nM 的花萼海绵诱癌素 A（磷酸酶抑制剂）处理细胞 1 小时。移除培养基后，用 25µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

将悬浮的人 THP1 细胞（急性单核细胞白血病细胞）接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下用 100nM 的花萼海绵诱癌素 A（磷酸酶抑制剂）处理 1 小时。处理后，用 10µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞（按照悬浮细胞方案操作）。

使用 HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 试剂盒评估 Ser259 位点的磷酸化 HDAC5 表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。注意，预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内进行（数据显示，HEK293、HEK293T 和 THP1 细胞的密度为 200,000 个细胞 / 孔，NIH3T3 细胞的密度为 50,000 个细胞 / 孔时，蛋白质表达水平显著更高）。

HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测能够有效检测各种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的内源性 pS259-HDAC5。

HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测与蛋白质印迹法的比较

在 T175 培养瓶中，用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养 THP1 细胞。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，用 3mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

使用补充的裂解缓冲液 #4 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 磷酸化 HDAC5 Ser259 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

HDAC5 信号通路

HDAC5 在调控与细胞增殖、分化、迁移和凋亡等细胞功能相关的基因中发挥关键作用。HDAC5 在细胞核内的积累由 N 端核定位信号（NLS）和 C 端核输出信号的活性平衡所调控。因此，HDAC5 根据其磷酸化状态在细胞核和细胞质之间动态穿梭。据报道，cAMP 信号传导会促进 HDAC5 在细胞核内的积累。HDAC5 会被 CAMK 激酶磷酸化，随后被输出到细胞质中，并被 14-3-3 伴侣蛋白封存。虽然 CaMKII 不直接与 HDAC5 结合，但 HDAC5 与 HDAC4 的异源寡聚化使 CaMKII 能够磷酸化 HDAC5。14-3-3 蛋白与 HDAC4 或 HDAC5 结合，足以诱导 HDAC4-HDAC5 复合物向核外输出，从而激活被 IIa 类 HDACs 抑制的转录因子（如 MEF2）。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白
目标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64HDAC5S9PEY

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