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HTRF IRS1 P-SER312 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷且准确地定量（小鼠 Ser307 / 人 Ser312）位点磷酸化的 IRS1。IRS1 是胰岛素抵抗、肿瘤发展和转移进展的相关标志物，与 2 型糖尿病、肥胖症和癌症相关。

工作原理

磷酸化 IRS1 检测原理

磷酸化 IRS1（小鼠 Ser307 / 人 Ser312）检测可测量在小鼠 Ser307 / 人 Ser312 位点发生磷酸化的 IRS1。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 IRS1（小鼠 Ser307 / 人 Ser312）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 IRS1 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 IRS1 HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 IRS1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 IRS1 可在同一板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

在 C2C12 小鼠肌管细胞上的磷酸化 IRS1 检测验证

培养 C2C12 细胞至 100% 汇合，随后在含 2% 马血清的培养基中培养 7 天以诱导分化。在无血清培养基中饥饿处理后，用促炎细胞因子混合物和 / 或胰岛素处理细胞。去除细胞上清液后，加入 1.5 mL 补充的 1 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。然后将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，使用磷酸化和总 IRS1 试剂盒试剂进行 HTRF 检测。

在 3T3-L1 小鼠脂肪细胞上的磷酸化 IRS1 检测验证

在含 10% 新生牛血清的培养基中培养 3T3-L1 细胞，随后在含 10% 胎牛血清（FCS）、胰岛素、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）和微摩尔级噻唑烷二酮的培养基中培养 7 天，以诱导其从成纤维细胞分化为脂肪细胞。在无血清培养基中饥饿过夜后，用 100 nM 胰岛素处理细胞 45 分钟，或用促炎细胞因子混合物处理 30 分钟。去除细胞上清液后，裂解细胞并将其转移至 384 孔低体积白色微孔板中，使用磷酸化和总 IRS1 试剂盒试剂进行 HTRF 检测（样品由法国尼斯 C3M 研究所 INSERM U1065/UNS 的 JF Tanti 研究团队友情提供）。

在 MCF-7 人乳腺癌细胞上的磷酸化 IRS1 检测验证

将 50,000 个人乳腺癌 MCF-7 细胞接种到 96 孔板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。加入不同浓度的胰岛素，在 37°C 下孵育 45 分钟。去除细胞培养基后，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。然后将 16 µL 裂解物转移至 384 孔白色低体积微孔板中，使用 4 µL HTRF 检测试剂检测 Ser312 磷酸化 IRS1 和总 IRS1。

HTRF 磷酸化 IRS1 检测与蛋白质印迹法的比较

将 3T3-L1 小鼠成纤维细胞接种到 12 孔板中，在含 10% 新生牛血清的完全培养基中、37°C、7% CO₂条件下培养。随后在含 10% 胎牛血清、5 µg/mL 胰岛素、0.25 µM 地塞米松、0.5 mM IBMX 和 10 µM 噻唑烷二酮的培养基中培养 7 天，诱导其从成纤维细胞分化为脂肪细胞。在无血清培养基中饥饿过夜后，用胰岛素处理细胞 45 分钟，或用促炎细胞因子混合物（10 ng/mL TNF-α + 10 ng/mL IL-1β）处理 30 分钟。去除细胞上清液后，用 600 µL 补充的 1 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后，将 16 µL 裂解物一式三份转移至 384 孔板进行 HTRF 检测，或转移至凝胶中进行 WB 检测。图表上的数据为每组三份样品的平均值。HTRF 检测比蛋白质印迹法具有更宽的药理学检测窗口。

简化通路

IRS1/PI3K/AKT 信号通路

IRS1/PI3K/AKT 信号通路的调控

通路抑制：酪氨酸磷酸化的 IRS-1 正向调节胰岛素信号，而丝氨酸磷酸化通常作为负反馈下调 IRS-1 功能。IRS-1 丝氨酸磷酸化水平升高是脂肪组织和骨骼肌中胰岛素抵抗的标志。胰岛素或 IGF-1 与 IR 或 IGF-1R 的细胞外 α 亚基结合，会触发受体跨膜 β 亚基的自磷酸化，从而激活受体。IRS1/AKT 通路的激活在维持葡萄糖稳态中起关键作用。AKT 还能激活 mTOR，mTOR 参与细胞生长、存活以及蛋白质合成。IRS1 下调是相关的糖尿病标志物，而其过表达与转移生长和癌症相关。
通路激活：胰岛素或 IGF-1 与 IR 或 IGF-1R 的细胞外 α 亚基（或两种受体的杂合体）结合，会触发受体跨膜 β 亚基的自磷酸化。随后，IRS-1 被激活的酪氨酸激酶受体招募，并在多个酪氨酸残基上发生磷酸化，在膜上形成 PI3K 的结合位点。PI3K 通路随之激活，下游的 AKT 发生磷酸化，进而磷酸化 AS160、GSK3 和 FoxO1，分别导致 GLUT4 转运 / 葡萄糖摄取、糖原合成以及糖异生抑制。因此，IRS1/AKT 通路的激活在维持葡萄糖稳态中起关键作用。AKT 还能激活 mTOR，mTOR 参与细胞生长、存活以及蛋白质合成。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）/ 纤维化
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64IRSPEY

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