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HTRF CRAF P-S43 KIT - 50K PTS

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品牌： Revvity

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概述

Phospho-c-RAF（Ser43）细胞检测试剂盒旨在通过简化的 “混合即读”、无需洗涤的实验方案，直接对 Ser-43 位点磷酸化的 cRaf 进行可靠定量。cRaf 在细胞增殖和分化中起着关键作用。该试剂盒可用于从基础研究到高通量药物筛选等多个领域，其多功能性使其适用于多种应用场景，包括基础研究、细胞模型中的药理学问题分析，以及肿瘤学和传染病研究。

检测原理
Phospho-c-RAF（Ser43）检测原理
Phospho-c-RAF（Ser43）检测用于测量 Ser43 位点磷酸化的 c-RAF。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。Phospho-c-RAF（Ser43）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且在无需洗涤的检测格式下即可评估蛋白质的磷酸化状态。

Phospho-c-RAF（Ser43）双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解；接着将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入 Phospho-c-RAF（Ser43）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

Phospho-c-RAF（Ser43）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 c-RAF（Ser43）可在同一板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持可靠的 HTRF 检测质量。

检测验证
TPA 刺激的 HeLa 细胞中总 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）的检测
将 HeLa 细胞以 100 µl 的体积接种于 96 孔板中（每孔 100,000 个细胞），使用完全培养基培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，移除培养基，加入 50 µl 无血清培养基，在 37°C、5% CO₂条件下使细胞饥饿 5 小时。随后，向细胞中加入 50 µl 不同浓度递增的 TPA，在 37°C、5% CO₂条件下处理 15 分钟。

移除培养基后，用 50 µL 补充的 2 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，然后将 16 µL 裂解物转移至白色小体积微孔板中，再加入 4 µL 预混合的 HTRF phospho-cRaf（Ser43）或总 cRaf 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

TPA 刺激的 HEK293T 细胞中总 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）的检测
将 HEK293T 细胞以 100 µl 的体积接种于 96 孔板中（每孔 100,000 个细胞），使用完全培养基培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，移除培养基，加入 50 µl 无血清培养基，在 37°C、5% CO₂条件下使细胞饥饿 5 小时。随后，向细胞中加入 50 µl 不同浓度递增的 TPA，在 37°C、5% CO₂条件下处理 15 分钟。

简化通路
RSK1 的功能与调控
RAF 原癌基因丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶（c-RAF）是 MAP 激酶通路的一部分，它将上游效应因子 Ras 与下游的 MAPK/ERK 级联反应连接起来。因此，它在细胞命运决定中发挥作用，包括增殖、分化、凋亡、存活和致癌转化。

c-RAF 的激活可通过 PKC 的直接或间接作用导致 Ser338 磷酸化，或通过 GTP 结合的 Ras 直接激活。而通过 MAPK/ERK 依赖性反馈导致的 Ser43 磷酸化可确保 c-RAF 的失活。

规格参数

其他规格
应用领域
细胞信号传导
兼容自动化操作
是
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
兼容裂解缓冲液
裂解缓冲液 1
裂解缓冲液 2
分子修饰
磷酸化
产品类别
试剂盒
样品体积
16 µL
运输条件
干冰运输
靶标类别
磷酸化蛋白
靶标物种
人
技术原理
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
心血管疾病
代谢 / 糖尿病
肿瘤学与炎症
产品规格
500 次检测

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货号：64CRAFS43PEY

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