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HTRF (H/M) PLK1 P-T210 KIT - CTRL LYSATE

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品牌： Revvity

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概述

这款基于细胞的均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂盒可对苏氨酸 210 位点磷酸化的 polo 样激酶 1（PLK1）进行快速定量检测。Polo 样激酶 1（PLK1）是高度保守的丝氨酸 / 苏氨酸激酶家族中的核心成员，对细胞分裂（有丝分裂）至关重要，因此是细胞周期中 G2/M 检查点的关键调控因子。

PLK1 在细胞周期调控中的激活机制：PLK1 可被 AurA 激酶磷酸化苏氨酸 210 位点而激活，激活后的 PLK1 会进一步磷酸化 CDC25。

PLK1 是调控有丝分裂及细胞周期进程 / 细胞增殖的关键蛋白，这使其成为极具吸引力的癌症治疗靶点。

工作原理

磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）检测原理

均相时间分辨荧光（HTRF）磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）检测可对苏氨酸 210 位点磷酸化的 PLK1 进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估蛋白质的磷酸化状态。

assay-principle-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）检测原理）

磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

assay-protocol-how-it-works-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）双板检测方案）

磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）单板检测方案

使用均相时间分辨荧光（HTRF）试剂检测总 PLK1 时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。

该方案专为高通量筛选（HTS）设计，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光（HTRF）检测质量。

assay-protocol-how-it-works-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）单板检测方案）

检测验证

HeLa 细胞中总 PLK1 及磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）的激活检测

将 HeLa 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。随后用浓度递增的诺考达唑（Nocodazole）处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。接着加入 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升总 PLK1 或磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。在室温下孵育 18 小时后，记录均相时间分辨荧光（HTRF）信号。

结果符合预期：诺考达唑以剂量依赖方式诱导 PLK1 的表达及磷酸化，半数有效浓度（EC50）约为 60-70 纳摩尔。

assay-validation-activator-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）激活剂检测验证）

利用磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）和总 PLK1 检测 HeLa 细胞中抑制剂的特性

将表达 PLK1 的 HeLa 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。随后用 200 纳摩尔诺考达唑（Nocodazole）与浓度递增的 PLK1 激活剂阿霉素（Doxorubicin）、两种 AuroraA 抑制剂（MLN8054 和 Alisertib）及蛋白降解剂（PROTAC）化合物 CC885 共同处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。之后移除培养基，加入 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）和总 PLK1 均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光（HTRF）信号。

结果符合预期：所有测试化合物均能诱导 PLK1 磷酸化水平下降，但半数有效浓度（EC50）不同 —— 阿霉素为 54 纳摩尔，MLN8054 约为 6 微摩尔，Alisertib 为 28 纳摩尔，蛋白降解剂 CC885 为 68 纳摩尔。

有趣的是，除 MLN8054 外，其他所有化合物均以相似方式降低 PLK1 的表达水平。

assay-validation-inhibitor-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）抑制剂检测验证）

多种人源和鼠源细胞系的检测验证

将贴壁生长的人源细胞（HeLa、MCF7、Hep-G2）和鼠源细胞（NIH 3T3）以每孔 25,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用 300 纳摩尔诺考达唑（Nocodazole）处理细胞，在 37°C 条件下孵育 16 小时。随后用补充后的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，再加入 4 微升磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光（HTRF）信号。

结果显示，均相时间分辨荧光（HTRF）磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）检测可在表达不同水平该蛋白的多种细胞模型中有效检测磷酸化 PLK1。

assay-validation-versatility-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）多细胞系检测验证）

磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。随后用 300 纳摩尔诺考达唑（Nocodazole）处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。接着加入 3 毫升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度）对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，再加入 4 微升磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。

取等量裂解液，通过蛋白质印迹法（Western Blot）与均相时间分辨荧光（HTRF）法进行平行对比检测。

结果显示，在此实验条件下，均相时间分辨荧光（HTRF）磷酸化 PLK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

assay-validation-wb-comparison-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）检测与蛋白质印迹法比较验证）

简化通路

PLK1 信号通路

PLK1（Polo 样激酶 1）在有丝分裂进程中发挥关键作用，近期研究表明，它还在 G2/M 检查点调控、DNA 损伤与复制应激反应及细胞死亡通路中具有重要作用。其信号传导机制较为复杂，涉及多个正反馈环路（如 Bora/AuroraA 通路）和负反馈环路（如 CHK1/ATR 或 CHK2/ATM 通路）。

PLK1 在细胞周期调控中的激活机制：PLK1 可被 AurA 激酶磷酸化苏氨酸 210 位点而激活，激活后的 PLK1 会进一步磷酸化 CDC25。

在自噬 / 凋亡过程中，PLK1 通过多种信号通路（包括 mTOR、c-myc 和 p53 通路）参与多种细胞死亡过程。

近期文献报道了 PLK1 的新功能 —— 参与炎症和免疫反应调控，包括 NF-κB 和 RIG-I/MAV 信号通路。

上述所有生物学过程在肿瘤中均会发生异常改变，且研究发现 PLK1 在多种肿瘤类型中常呈高表达状态，而这种高表达与患者预后不良相关。因此，靶向 PLK1 已成为一种极具潜力的抗癌治疗策略。

pathway-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：PLK1 信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：均相时间分辨荧光（HTRF）
检测方式：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10000 次检测

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货号：64PLKT2TDA

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