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HTRF JAK1 P-Y1034/35 KIT - 10K PTS

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概述

JAK1（Janus 激酶 1）属于非受体型 Janus 酪氨酸激酶家族，该家族还包括 JAK2、JAK3 和 TYK2。多种细胞因子和生长因子（如 IL6、IL4、IFNα、GM-CSF）与其受体结合后，会诱导 JAKs 磷酸化。激活的 JAKs 随后会磷酸化其他靶标，包括细胞因子受体和主要底物 STATs。JAKs/STATs 信号通路可刺激细胞增殖、分化、迁移和凋亡。通过调控 JAK/Stat 信号通路以减少细胞因子诱导的促炎反应，已成为抗炎治疗的重要潜在靶点。

工作原理

磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）检测原理

磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）检测用于测定 Tyr1034/1035 位点磷酸化的 JAK1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

利用磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）和总 JAK1 试剂盒在 HEL92.1.7 细胞中检测抑制作用

将 HEL92.1.7 细胞（人红白血病细胞）以 300,000 个细胞 / 孔的密度接种到半区 96 孔培养处理板中，每孔加入 20 µL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下，用 5 µL 不同浓度的鲁索替尼或乌帕替尼处理细胞 1 小时，随后用 5 µL 含 100 µM 过钒酸盐、100 ng/mL IL4 和 100 ng/mL IFNγ 的混合液刺激细胞 30 分钟。处理后，加入 10 µL 补充的 4 号裂解缓冲液（4X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）或总 JAK1 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，结果显示用鲁索替尼或乌帕替尼处理后，JAK1 Y1034/1035 位点的磷酸化呈剂量依赖性抑制，而 JAK1 的表达水平保持恒定。

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Hep-G2 细胞中 JAK1（Tyr1034/1035）磷酸化的抑制作用

将人 HEP-G2 细胞（肝癌细胞）以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时。在 37°C、5% CO₂条件下，用剂量梯度的鲁索替尼或乌帕替尼过夜处理细胞。随后用含 100 µM 过钒酸盐、100 ng/mL IL6、100 ng/mL IL4 和 100 ng/mL IFNγ 的混合液在 37°C、5% CO₂条件下刺激细胞 1 小时。然后加入 25 µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 JAK1（Tyr1034）或总 JAK1 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，两种抑制剂均诱导 JAK1 磷酸化呈剂量依赖性降低，且对总蛋白的表达水平无影响。

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siRNA 对磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）的下调作用

在 96 孔板中，用 2.5 µM 的 Accell siRNA（Horizon）分别特异性靶向 JAK1、JAK2、JAK3，或用非靶向 siRNA（作为对照）处理 HEL92.1.7 细胞（200,000 个细胞 / 孔），每孔体积为 100 µL。在 37°C 条件下孵育 48 小时后，加入 50 µL 完全培养基，继续在 37°C 条件下孵育 24 小时。用 100 µM 过钒酸盐、IL4 和 IFNγ 刺激细胞 30 分钟，平板离心后，用 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）检测抗体。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

JAK1 siRNA 处理细胞后，磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）显著下调，与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，信号降低了 65%。用 JAK2 或 JAK3 siRNA 处理的细胞未观察到信号降低，这证明了该试剂盒的特异性。

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HTRF 磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）检测与蛋白质印迹法的比较

HEL92.1.7 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 72 小时后，先用 100 µM 过钒酸盐、IL4 和 100 ng/mL IFNγ 刺激细胞，然后加入 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 JAK1（Tyr1034/1035）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

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简化通路

简化的 JAK1 信号通路

JAK1 与 JAK2、JAK3 或 Tyk2 共同作用，与不同类型的细胞因子 / 干扰素受体（IL2、IL4、IL6、IFNα 和 IFNγ）相互作用。细胞因子激活后，JAK1 和 JAK 家族的其他成员发生相互转磷酸化，随后激活转录因子 STAT1、STAT2、STAT3、STAT5 和 STAT6，这些转录因子发生二聚化后转运至细胞核，触发调控细胞分化、增殖、存活和适应性免疫反应的基因转录。

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规格

其他规格
应用：细胞信号传导
自动化兼容性：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64JAK1Y10PEH

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