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HTRF JAK2 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

JAK2（Janus 激酶 2）属于非受体型 Janus 酪氨酸激酶家族，该家族还包括 JAK1、JAK3 和 TYK2。多种细胞因子和生长因子（如 IL6、IL4、α 干扰素、粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子）与它们的受体结合后，会诱导 JAKs 磷酸化。激活的 JAKs 随后会磷酸化其他靶标，包括细胞因子受体和主要底物 STATs（信号转导和转录激活因子）。JAKs/STATs 信号通路可刺激细胞增殖、分化、迁移和凋亡。改变 JAK/Stat 信号通路以减少细胞因子诱导的促炎反应，是抗炎治疗中一个极具吸引力的靶点。

工作原理

总 JAK2 检测原理

总 JAK2 检测用于定量细胞裂解物中 JAK2 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 JAK2 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 JAK2 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质表达提供了便利。

总 JAK2 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入总 JAK2 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

总 JAK2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 JAK2 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

使用磷酸化 JAK2（Tyr1007/1008）和总 JAK2 试剂盒在 HEL92.1.7 细胞上测量抑制效果

将 HEL92.1.7 细胞（人红白血病细胞）以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到半区 96 孔培养处理板中，每孔加入 20 µL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下，用 5 µL 不同浓度的鲁索替尼（I 型 JAK 抑制剂）或 CHZ868（II 型 JAK 抑制剂）处理细胞 1 小时，随后加入 5 µL 100 µM 的过钒酸盐刺激 30 分钟。处理后，加入 10 µL 补充的 1 号裂解缓冲液（4X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔白色小体积微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 JAK2（Tyr1007/1008）或总 JAK2 检测试剂。在室温下放置 3 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，用鲁索替尼或 CHZ868 处理后，抑制剂以剂量依赖性方式降低 JAK2 的磷酸化水平，而对总蛋白的表达水平没有影响。

THP1 细胞中 JAK2（Tyr1007/1008）磷酸化的抑制作用

将 THP1 细胞（人单核细胞白血病细胞）以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到半区 96 孔培养处理板中，每孔加入 20 µL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下，用 5 µL 不同浓度的鲁索替尼、托法替尼或帕瑞替尼处理细胞 1 小时，随后加入 5 µL 100 µM 的过钒酸盐刺激 30 分钟。处理后，加入 10 µL 补充的 1 号裂解缓冲液（4X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

正如预期的那样，结果显示用鲁索替尼、托法替尼或帕瑞替尼处理后，JAK2 Y1007/1008 的磷酸化受到剂量依赖性抑制，而 JAK2 的表达水平保持恒定。

小干扰 RNA（siRNA）对总 JAK2 的下调作用

在 96 孔板中，每孔 200,000 个 HEL92.1.7 细胞，加入 100 µL 培养基，并用 2.5 µM 的 Accell siRNA（Horizon 公司）（特异性靶向 JAK2）或非靶向 siRNA（作为对照）处理细胞。在 37°C 下孵育 48 小时后，加入 50 µL 完全培养基，再在 37°C 下孵育 24 小时。离心平板后，用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到白色小体积微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 JAK2 检测抗体。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，用 JAK2 siRNA 处理的细胞中总 JAK2 显著下调，信号降低了 77%。

HTRF 总 JAK2 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HEL92.1.7 细胞在 T175 培养瓶中，于 37°C、5% CO₂的完全培养基中培养。孵育 72 小时后，用 3 mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移到白色小体积微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 JAK2 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 检测的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

简化的 JAK2 信号通路

JAK2 与 JAK1、JAK3 或 Tyk2 共同作用，与不同类型的细胞因子 / 干扰素受体（如 IL2、IL4、IL6、α 干扰素和 γ 干扰素受体）相互作用。当细胞因子激活受体后，JAK2 和 JAK 家族的其他成员会相互转磷酸化，然后激活转录因子 STAT1、STAT2、STAT3、STAT5 和 STAT6。这些转录因子进而二聚化并转运到细胞核中，触发调控细胞分化、增殖、存活和适应性免疫反应的基因转录。

规格参数

其他规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64JAK2TPEY

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