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HTRF (H) IKKA TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

核因子 κB 激酶亚基 α 抑制剂（IKKα）也称为 IKK1，是一种由 CHUK 人类基因编码的蛋白激酶。IKKα 是 IκB 激酶复合物（IKK）的组成部分，该复合物由催化亚基 IKKα、IKKβ 和调节亚基 NF-κB 必需调节剂（NEMO，即 IKKγ）组成。

IKK 复合物的激活依赖于 IKKβ（丝氨酸 177/180）或 IKKα（丝氨酸 176 / 丝氨酸 180）的磷酸化，这会导致复合物构象变化和激酶激活。IKKα 是 NF-κB 通路的关键调节因子，位于多种促炎因子的下游，包括白细胞介素 - 1、肿瘤坏死因子 α（TNFα）和 toll 样受体激动剂。尽管 IKKα 和 IKKβ 高度同源，结构相似性超过 50%，但它们具有不同的下游底物和非重叠的功能。

工作原理

总 IKKα 检测原理

总 IKKα 检测用于定量细胞裂解物中 IKKα 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 IKKα 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对目标蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 IKKα 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样品中目标蛋白的浓度直接成正比，并且可在无需洗涤的检测格式中评估蛋白质的表达水平。

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总 IKKα 双板检测方案

双板方案包括在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，然后添加总 IKKα HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

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总 IKKα 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 IKKα 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

基于 HeLa 细胞的磷酸化 IKKα（丝氨酸 176/180）激活检测

HeLa 细胞（永生化人宫颈癌细胞系）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中培养 24 小时以使其贴壁。移除细胞培养基后，用递增浓度的 IL-1β 处理细胞，并在含 10% 胎牛血清（FCS）的细胞培养基中与 100 nM 的冈田酸（Calyculin A）共同孵育，在 37°C、5% CO₂条件下处理 15 分钟。处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 IKKα 或磷酸化 IKKα（丝氨酸 176/180）检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

已有研究表明，包括 IL-1β 在内的细胞因子可激活 IKK 复合物并诱导磷酸化 IKKα（丝氨酸 176/180）的磷酸化。正如预期的那样，结果显示 IL-1β 处理后，IKKα 在丝氨酸 176 和丝氨酸 180 位点的磷酸化呈明显的剂量依赖性激活，而总 IKKα 蛋白的表达水平保持恒定。

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基于 HeLa 细胞的磷酸化 IKKα（丝氨酸 176/180）和总 IKKα 的抑制剂表征

HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后用剂量递增的 5Z-7 - 氧杂 zeaenol（一种 TAK1 抑制剂）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 1 小时。接下来，细胞在含 2 nM IL-1β 和 100 nM 冈田酸的细胞培养基中，于 37°C、5% CO₂条件下共同孵育 15 分钟，随后用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 IKKα 或磷酸化 IKKα（丝氨酸 176/180）检测抗体。室温 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。正如预期的那样，该抑制剂诱导 IKKα（丝氨酸 176/180）磷酸化呈剂量依赖性降低，而对总 IKKα 蛋白的表达水平无影响。

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总 IKKα 检测特异性验证

使用 HTRF 人总 IKKα 试剂盒在 HAP1 细胞（野生型，WT）以及不同的 IKKα 敲除或 IKKβ 敲除 HAP1 细胞系中评估总 IKKα 蛋白水平。预先优化细胞密度以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

将不同细胞系接种在 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。然后用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 细胞裂解物转移到低体积白色微孔板中，随后加入 4 µL 预混合的检测试剂。室温 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 IKKα 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 IKKα 基因完全沉默；而正如预期的那样，在其他细胞系中可良好检测到 IKKα 水平。

值得注意的是，野生型和 IKKβ 敲除细胞系中 IKKα 的表达水平相近，这表明尽管这两种蛋白的序列同源性超过 50%，但 HTRF 总 IKKα 试剂盒对 IKKα 相对于 IKKβ 仍具有选择性。

细胞系参考目录（Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631；HAP1 IKKα 敲除 #HZGHC000003c011；HAP1 IKKβ 敲除 #HZGHC023808c011

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多种细胞模型中的总 IKKα 检测

将贴壁人类细胞系 HeLa（宫颈癌细胞）、HAP1（慢性粒细胞白血病细胞）和小鼠细胞系 Neuro2a（神经母细胞瘤细胞）以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除细胞培养基后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

将悬浮人类细胞系 THP-1（单核细胞白血病细胞）和 MOLT-4（T 淋巴细胞白血病细胞）以 30 µL / 孔的体积、200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后用 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

使用 HTRF 总 IKKα 试剂盒评估 IKKα 蛋白表达水平。简要步骤为：将 16 µL 细胞裂解物转移到低体积白色微孔板中，随后加入 4 µL 预混合的 HTRF 检测试剂。室温 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。注意，预先优化了细胞密度以确保 HTRF 检测在试剂盒的动态范围内。

HTRF 总 IKKα 检测可有效检测各种人类细胞模型中内源性 IKKα 蛋白的表达，这些模型中该蛋白的表达水平各不相同。

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HTRF 总 IKKα 检测与蛋白质印迹法的比较

HeLa 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 24 小时后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移到低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 总 IKKα 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

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简化通路

IKKα 信号通路

NF-κB 通路参与免疫反应、细胞生长和凋亡的调节。这些通路可通过经典通路或替代通路激活。经典通路的激活会刺激多种激酶，包括 TAK1，TAK1 通过磷酸化 IKKβ（丝氨酸 177 / 丝氨酸 181）或 IKKα（丝氨酸 176 / 丝氨酸 180）亚基激活 IκB 激酶复合物（IKK）。受刺激后，IKK 复合物磷酸化 IκBα，使 p50-p65 能够转运到细胞核中。替代通路的激活会导致 NIK 激活，进而磷酸化 IKKα 亚基。

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规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 4
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷蛋白
目标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64KKATPEG

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