当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF (H) KRAS TOTAL KIT - 500 PTS

HTRF (H) KRAS TOTAL KIT - 500 PTS

分享给好友

rvty_ls_sds_64KRASTPEG_US rvty_ls_sds_64KRASTPEG_UK rvty_ls_sds_64KRASTPEG_SPA rvty_ls_sds_64KRASTPEG_ITA rvty_ls_sds_64KRASTPEG_ELL rvty_ls_sds_64KRASTPEG_DEU rvty_ls_sds_64KRASTPEG_FRA

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

KRAS 是一种单体 GTP 酶，可传递来自受体酪氨酸激酶的信号，从而促进细胞增殖、分化或存活。KRAS 是癌症中最常见的突变癌基因之一，其突变通常与不良预后和治疗耐药性相关。KRAS G12C 突变是较常见的 KRAS 突变类型之一。KRAS G12C 具有组成型活性，处于持续的 GTP 结合状态，导致 KRAS 效应因子信号 MAPK 通路过度激活，进而驱动肿瘤生长。

工作原理

总 KRAS 检测原理

总 KRAS 检测用于定量细胞裂解物中 KRAS 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 KRAS 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对目标蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 KRAS 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中目标蛋白的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的表达水平。

HTRF 总 DDR1 检测原理

总 KRAS 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入 HTRF 总 KRAS 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 磷酸化 Y1604 ALK 检测双板方案
总 KRAS 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 KRAS 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 磷酸化 Y1604 ALK 检测单板方案

检测验证

利用 PROTAC® 在多种细胞系中选择性降解 KRAS G12C

将 Mia-Paca-2、SW1573 和 Calu-1 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，用浓度递增的 LC-2 PROTAC（旨在诱导 KRAS G12C 突变体降解）以及 MRTX-849（KRAS G12C 的共价抑制剂和 LC-2 PROTAC 的弹头）处理细胞 24 小时。对于对照条件，在添加 PROTAC 之前，细胞先用蛋白酶体抑制剂埃博霉素（1 µM）在 37°C 下预孵育 1 小时。

处理后，用 50 µL 补充的 6 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。随后，将 16 µL 经补充的 6 号裂解缓冲液稀释一半的裂解物转移至 ProxiPlate-384 微孔板（#6008280/9）中，并加入 4 µL HTRF 总 KRAS 检测抗体。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

同时，将 4 µL 裂解物（补充 12 µL 8 号稀释剂）转移至微孔板中，使用 HTRF α- 微管蛋白内参细胞检测试剂盒（64ATUBPEG/H）检测 α- 微管蛋白内参蛋白。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

结果显示，LC-2 PROTAC 在所有三种细胞系中均触发 KRAS 蛋白水平呈剂量依赖性降低，而特异性 KRAS G12C 抑制剂 MRTX-849 则无此作用。在埃博霉素存在的情况下未观察到 KRAS 减少，这证实降解是由泛素 - 蛋白酶体系统驱动的。在相同实验条件下，α- 微管蛋白水平保持不变（数据未显示）。

检测验证
检测验证
检测验证

利用 HAP-1 KRAS 敲除细胞系验证 HTRF 总 KRAS 检测的特异性

根据 Revvity 的 Horizon Discovery 团队的数据，对 HAP-1 细胞中 KRAS、HRAS 和 NRAS 基因的 RNA 表达水平进行定量。结果显示，HAP-1 细胞中这三种基因均有显著的 RNA 表达（目录参考 Revvity 的 Horizon Discovery 产品：HAP1 野生型 #C631）。

制备 HAP1 野生型和 HAP1-KRAS 敲除细胞（目录参考 Revvity 的 Horizon Discovery 产品：HAP1 KRAS 敲除 #HZGHC005816c001）的细胞裂解物，并用 HTRF 总 KRAS 试剂盒进行检测，以验证 KRAS 检测的特异性。该检测旨在确保对 KRAS 的检测不会与 NRAS 和 HRAS 发生交叉反应。

结果显示，在表达 NRAS 和 HRAS 的 HAP-1 KRAS 敲除细胞中未检测到 HTRF 信号，证实该试剂盒仅对 KRAS 具有特异性检测能力。

检测验证
检测验证

多种细胞系中总 KRAS 表达水平的定量

制备具有不同 12 号密码子基因型谱的多种商用细胞系的细胞裂解物，并用 HTRF 总 KRAS 试剂盒进行检测。在所有受测细胞系中均观察到显著的 KRAS 表达检测结果（见表）。

使用 HTRF 总 KRAS 试剂盒在三种表达 KRAS G12C 的纯合细胞模型和一种同时表达野生型和 G12C 等位基因的模型中监测 KRAS 水平。使用 HTRF α- 微管蛋白内参细胞检测试剂盒（64ATUBPEG/H）检测 α- 微管蛋白表达作为参考基因。

商用细胞系	12 号密码子纯合性	HTRF 总 KRAS 试剂盒检测结果
HT-29	纯合野生型	✓
RKO	纯合野生型	✓
HCT-116	纯合野生型	✓
SW1463	纯合 G12C	✓
SW1573	纯合 G12C	✓
Mia-PaCa-2	纯合 G12C	✓
Calu-1	纯合 G12C	✓
AsPC-1	纯合 G12D	✓
SW480	纯合 G12V	✓
NCI-H358	杂合 G12C / 野生型	✓

检测验证
检测验证

HTRF 总 KRAS 检测与蛋白质印迹法的比较

SW480 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养至 80% 汇合度。移除培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

检测验证
用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 KRAS 检测试剂。取等量裂解物用于 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

结果显示，使用 HTRF 总 KRAS 检测时，4000 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 31000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总 KRAS 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 7.5 倍。

简化通路

KRAS 信号通路

KRAS 是一种小型 GTP 酶，作为分子开关发挥作用，在活性 GTP 结合状态和非活性 GDP 结合状态之间循环。在受到上游信号（如生长因子与受体酪氨酸激酶（RTKs）结合）激活后，KRAS 会激活多个下游效应通路，最显著的是 RAF-MEK-ERK 通路和 PI3K-AKT 通路。RAF-MEK-ERK 通路促进细胞增殖和分化，而 PI3K-AKT 通路支持细胞存活和代谢。KRAS 的突变（尤其是 12、13 和 61 号密码子的突变）可使 KRAS 锁定在活性状态，导致细胞不受控制地分裂并引发癌症。这种失调在多种癌症中常见，包括胰腺癌、结直肠癌和肺癌。

简化通路

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
缓冲液 / 溶剂：6 号裂解缓冲液
检测方式：HTRF
宿主物种：人
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标：KRAS
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症、肿瘤
单位规格：500 次检测

没有数据

货号：64KRASTPEG

一键复制

参考价格 ¥ 29723.99

产品规格

请咨询￥29723.99

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价