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HTRF SMAD3 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 SMAD3 细胞检测试剂盒旨在监测 SMAD3 的表达水平，无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。该试剂盒与我们的磷酸化 SMAD3 试剂盒兼容，能够从单个样本中同时分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地反映 TGF-ß 信号活性。

工作原理

总 SMAD3 检测原理

总 SMAD3 检测用于定量细胞裂解物中 SMAD3 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 SMAD3 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SMAD3 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达。

总 SMAD3 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，最后添加总 SMAD3 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 SMAD3 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SMAD3 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

肝细胞和肝星状细胞中 TGF-ß/SMAD 信号的过度激活会促进肝纤维化

将人类 LX-2 * 和 HepG2 细胞系接种（分别为 50,000 和 200,000 个细胞 / 孔），并在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。然后用不同浓度的 TGF-ß1 在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 30 分钟。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16µL 裂解物分两次转移到小体积白色微量检测板中，然后添加 4µL HTRF 磷酸化 SMAD3 或总 SMAD3 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。在这两种细胞系中，TGF-ß1 处理会诱导 SMAD3 在 Ser423/425 位点发生磷酸化，而该蛋白的表达水平未受到显著影响。

*LX-2 细胞系由 EMD Millipore 提供（货号 #SCC064）

在小鼠细胞系 NIH/3T3 和 C2C12 上的验证

将小鼠 NIH/3T3 和 C2C12 细胞系接种（100,000 个细胞 / 孔），并在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养 2 小时。次日，用不同浓度的 TGF-ß1 在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 30 分钟。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16µL 裂解物分两次转移到小体积白色微量检测板中，然后添加 4µL HTRF 磷酸化 SMAD3 或总 SMAD3 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。在这两种细胞系中，TGF-ß1 通过使 SMAD3 在 Ser423/425 位点发生磷酸化来促进其激活，而该蛋白的表达水平保持相对稳定。

利用总 SMAD3 检测进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将细胞培养至 80% 汇合度，并用 TGF-ß1 处理 30 分钟。裂解后，通过离心收集可溶性上清液。对裂解物进行系列稀释，转移到小体积白色微量检测板中，最后添加 HTRF 磷酸化 SMAD3 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。结果表明，HTRF 磷酸化 SMAD3 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

简化通路

TGF-ß 信号通路

TGF-ß 信号通过 TßRI 和 TßRII 复合物介导，该复合物通过磷酸化激活细胞内的 SMAD3。TGF-ß 配体与 TßRII 结合后，会触发 TßRI 募集到配体 - 受体复合物中。TßRII 发生自磷酸化，然后转磷酸化 TßRI。激活的 TßRI 进而使 SMAD3 在 Ser423 和 Ser425 位点发生磷酸化，使其能够与 SMAD4 形成寡聚体。该复合物随后转运至细胞核，与共激活因子和共抑制因子一起作为转录因子，调控多个参与细胞生长、凋亡、增殖、迁移和分化以及细胞外基质重塑和免疫 / 炎症反应的基因的表达。抑制性 SMAD6 和 SMAD7 参与该通路的反馈抑制。

规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样本体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管疾病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64ND3PEY

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