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HTRF PLCG1 P-Y783 KIT - 50K PTS

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概述

这款基于 HTRF 的细胞检测方法可便捷、准确地检测酪氨酸 783（Tyr783）位点磷酸化的磷脂酶 Cγ1（PLCγ1）。

PLCγ1 是一种磷酸肌醇特异性磷脂酶，能生成第二信使，在信号转导中发挥关键作用。当细胞受到刺激时，PLCγ1 会与酪氨酸激酶受体及 T 细胞受体等其他受体相互作用，通过 Tyr783 位点的磷酸化被激活。

PLCγ1 是多种疾病中的潜在靶点。例如，已有研究报道在血管肉瘤和 T 细胞淋巴瘤中，PLCG1 基因频繁发生突变，且其激活还与乳腺癌的扩散有关。

工作原理

磷酸化 PLCγ1（Tyr783）检测原理

磷酸化 PLCγ1（Tyr783）检测用于测量 Tyr783 位点磷酸化的 PLCγ1。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测采用两种抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

phospho-plcgamma1-y783-assay-principle（磷酸化 PLCγ1（Tyr783）检测原理）

磷酸化 PLCγ1（Tyr783）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化 PLCγ1（Tyr783）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 PLCγ1（Tyr783）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 PLCγ1（Tyr783）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

抗 CD3 刺激的 Jurkat T 细胞中 PLCγ1 的激活

将人 Jurkat T 细胞系以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到半面积 96 孔培养处理板中，每孔加入 25µL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 3 小时后，用 5µL 不同浓度的 CD3 抗体刺激细胞 2 分钟，然后加入 10µL 补充的 3 号裂解缓冲液（4X），在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。检测时，将 16µL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 PLCγ1（Tyr783）或总 PLCγ1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

抗 CD3 抗体诱导 PLCγ1 在 Tyr783 位点的磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白质的表达水平未发生改变，这表明细胞表面的 T 细胞受体（TCR）复合物被激活。

表皮生长因子（EGF）刺激的 A431 细胞中 PLCγ1 的激活

将人 A431 细胞系以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，每孔加入 50µL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，用 50µL 不同浓度的 EGF 刺激细胞 5 分钟。

裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测量磷酸化和总 PLCγ1。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

EGF 诱导 PLCγ1 在 Tyr783 位点的磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白质的表达水平未发生改变，这表明细胞表面的酪氨酸激酶受体表皮生长因子受体（EGFR）被激活。

血小板衍生生长因子 - BB（PDGF-BB）刺激的 NIH-3T3 细胞中 PLCγ1 的激活

将小鼠 NIH-3T3 细胞系以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，每孔加入 50µL 完全培养基。在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，用 50µL 不同浓度的 PDGFR-BB 刺激细胞 30 分钟。

裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测量磷酸化和总 PLCγ1。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

NIH-3T3 细胞中，PLCγ1 在 Tyr783 位点的磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白质的表达水平未发生改变，这表明细胞表面的酪氨酸激酶受体血小板衍生生长因子受体（PDGFR）被激活。

HTRF 磷酸化 PLCγ1（Tyr783）检测与蛋白质印迹法的比较

将人 Jurkat T 细胞系在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养 48 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂。离心后，用 5µg/mL 的抗 CD3 抗体刺激沉淀细胞 2 分钟。然后加入 3 号裂解缓冲液（2X），在室温下轻轻振荡 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 PLCγ1（Tyr783）检测试剂。取等量裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 PLCγ1（Tyr783）检测时，每孔 500 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 4,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 磷酸化 PLCγ1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

PLCγ1 信号传导的简化通路

PLCγ1（磷脂酶 Cγ1）是一种胞质酪氨酸激酶，在受体或非受体酪氨酸激酶的信号转导中发挥关键作用。

当 T 细胞受到刺激时，Src 家族蛋白会使 T 细胞抗原受体（TCR）上的基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAMs）磷酸化。磷酸化的 ITAMs 会招募 ZAP-70 和 SLP-76，它们与 PLCγ1 结合，通过使其 Tyr783 催化结构域磷酸化而激活 PLCγ1。

此外，受体酪氨酸激酶的激活会通过 PLCγ1 的 N 端 SH2 结构域与膜结合，从而诱导 PLCγ1 在 Tyr783 位点发生磷酸化。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64PLCG1Y3PEY

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