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HTRF SHP1 TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

总 SHP1 细胞检测可监测 SHP1 的表达水平，并能与我们的磷酸化 SHP1 Y564 试剂盒搭配作为归一化检测使用。由于这些磷酸化和总 SHP1 检测具有兼容性，两种试剂盒可在相同裂解物上并行使用。

许多癌细胞会过度表达检查点抑制剂配体，如 PD-L1。PD-L1 与其对应的检查点抑制剂受体 PD1 结合，而 PD1 存在于 T 淋巴细胞表面。反过来，PD1-PDL1 复合物会招募并激活抑制性效应因子，如 SHP1 或 SHP2。这两种磷酸酶分别在酪氨酸 564（Tyr564）和酪氨酸 542（Tyr542）位点被激酶 Lck 磷酸化，进而触发 T 细胞活化通路中相关信号蛋白（如 ZAP-70 或 SLP-76）的去磷酸化。最终，活化的 SHP1 和 SHP2 会参与 T 细胞的失活过程。

研究认为，通过小分子抑制剂阻止 SHP1 和 / 或 SHP2 的活化，有助于恢复机体对肿瘤的免疫应答。

工作原理

总 SHP1 检测原理

总 SHP1 检测可测量 SHP1 的表达水平，且不受其磷酸化状态的影响。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 SHP1 检测使用两种标记抗体，一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SHP1 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且在无需洗涤的检测格式中即可评估蛋白质的表达水平。

（图：assay-principle-total-with-phospho.png）

总 SHP1 双板检测方案

双板方案包括在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，然后再加入总 SHP1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

（图：assay-protocol-how-it-works-2-plates.png）

总 SHP1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SHP1 可在单个平板中完成，该平板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

（图：assay-protocol-how-it-works-1-plate.png）

检测验证

在 Jurkat T 细胞中使用 Lck 抑制剂 saracatinib 进行药理学验证

将人 Jurkat 悬浮细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔半区板中，在 37°C、5% CO₂条件下与不同浓度的 saracatinib 共同孵育 24 小时。裂解前，Jurkat 细胞与过钒酸盐（30 µM）孵育 30 分钟，随后加入 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 SHP1（Tyr564）或总 SHP1 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如其他研究所述，saracatinib 处理后可观察到 SHP1 Tyr564 磷酸化的剂量依赖性抑制，而在相同实验条件下，SHP1 的表达水平保持稳定。

（图：assay-validation-shp1-total-1.svg）

HTRF 总 SHP1 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 Jurkat 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。然后用 30 µM 过钒酸盐处理细胞 30 分钟，之后进行裂解。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 SHP1 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

对于 HTRF 总 SHP1 检测和蛋白质印迹法，每孔 5,000 个细胞就足以检测到信号，这表明两种方法的灵敏度相近。

（图：assay-validation-shp1-total-2.svg）

简化通路

SHP1 的功能与调控

SHP1（也称为非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 6，PTPN6）是一种主要在造血细胞中表达的酪氨酸磷酸酶，由 Lck 激活并通过细胞表面受体招募。SHP2（也称为非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 11）在造血细胞和非造血细胞中均广泛表达。尽管 SHP2 负调控 T 细胞活化，但它在响应 PDGF 或 FGF 等生长因子时，对 ERK 活化具有正向调控作用。

在 T 淋巴细胞中，SHP1 和 SHP2 被免疫检查点抑制剂招募，从而参与 TCR 信号通路的抑制。SHP1 和 SHP2 与 PD1 的 ITIM 结构域相互作用，并被 Lck 激酶磷酸化激活。活化的 SHP1 和 SHP2 磷酸酶会导致 TCR 信号通路中的关键效应因子（如 ZAP70 或 SLP76）去磷酸化，而这些因子是 T 细胞增殖和功能所必需的。

（图：phospho-pathway-shp1-total-kit-64NH1PEG-64NH1PEH-64NH1PEY.svg）

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：
- 裂解缓冲液 2
- 裂解缓冲液 3
- 裂解缓冲液 4
- 裂解缓冲液 5
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：
- 传染病
- 肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64NH1PEG

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