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HTRF ZAP-70 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 ZAP-70 细胞检测旨在监测 ZAP-70 蛋白（包括磷酸化和非磷酸化形式）的表达水平。它与我们的磷酸化 ZAP-70 试剂盒兼容，能够从单个样本中分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地解读 T 细胞活化情况。ZAP-70 是一种在 T 细胞和自然杀伤细胞中表达的胞质蛋白酪氨酸激酶，在抗原受体启动 T 细胞应答的相关事件中发挥关键作用。

工作原理

总 ZAP-70 检测原理

总 ZAP-70 检测可定量细胞裂解物中 ZAP-70 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 ZAP-70 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 ZAP-70 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达的方法。

总 ZAP-70 双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 ZAP-70 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 ZAP-70 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 ZAP-70 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在人 Jurkat 细胞上使用 ZAP-70 细胞检测进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

Jurkat 细胞在添加 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基中，于 37°C、5% CO₂环境下的 T175cm² 培养瓶中培养 2 天。取 4.5ml 细胞悬液（13×10⁶个细胞 /ml），用抗 CD3 抗体（终浓度 20µg/ml）刺激 2.5 分钟。刺激后，加入 2.25ml 4 倍浓度的补充裂解缓冲液，在室温下裂解细胞 30 分钟。然后用相同的补充裂解缓冲液对纯裂解物进行系列稀释。取 16µL 各稀释液分别通过 HTRF 或蛋白质印迹法进行平行分析。

细胞刺激动力学 —— 总 ZAP-70 检测

本检测采用双板检测方案进行。将 Jurkat 细胞以 40 万个细胞 / 孔、25µL / 孔的量接种到 96 孔培养板中，使用含 10% 胎牛血清的完全 RPMI 培养基。用终浓度为 20µg/ml 的抗 CD3 抗体在不同刺激时间（分钟）下刺激细胞。刺激后，用 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞。取 16µL 各类型细胞裂解物，用 HTRF 总 ZAP-70 检测试剂盒进行分析。

免疫检查点抑制剂 PD-L1 活性的监测

由于磷酸化 ZAP-70（Tyr319）是 T 细胞活化的读出指标，因此可用于监测 PD-L1 重组蛋白对 T 细胞活化的抑制作用。本检测采用双板检测方案进行。将 40 万个 Jurkat 细胞以 25µL 含 10% 胎牛血清的完全 RPMI 培养基接种到 96 孔培养板中。将细胞与不同浓度的 PD-L1 重组蛋白预孵育 24 小时。然后用 20µg/ml 的抗 CD3 抗体（终浓度）刺激细胞 2.5 分钟，直接加入 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞，随后在室温下孵育 30 分钟。取 16µL 各样品，用磷酸化 ZAP-70（Tyr319）和总 ZAP-70 检测试剂盒进行分析。将磷酸化 ZAP-70 的结果以总 ZAP-70 的量进行标准化后绘制图表。结果显示，当 PD-L1 重组蛋白的终浓度为 40µg/ml 时，磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测记录到其具有轻微但显著的抑制作用。

简化通路

ZAP-70 的功能与调控
T 细胞受体（TCR）结合会促进淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（Lck）对 TCR/CD3 复合物胞质侧的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAMs）进行磷酸化。ZAP-70 被募集到 TCR/CD3 复合物上，在此发生磷酸化并被激活，进而促进下游衔接蛋白或支架蛋白的募集与磷酸化。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64ZATPEY

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