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HTRF IRS1 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

HTRF 总 IRS1 检测试剂盒设计用作我们磷酸化 IRS1 试剂盒的归一化检测工具。总 IRS1 检测最适合监测胰岛素抵抗。IRS1 是胰岛素抵抗、肿瘤发展和转移进展的相关标志物，与 2 型糖尿病、肥胖症和癌症相关。

工作原理

总 IRS1 检测原理

总 IRS1 检测可定量细胞裂解物中 IRS1 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 IRS1 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白质上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 IRS1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质表达的方法。

总 IRS1 双板检测方案

双板方案包括在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，然后添加总 IRS1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

总 IRS1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 IRS1 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在 C2C12 小鼠肌管上的总 IRS1 检测验证

培养 C2C12 细胞直至达到 100% 汇合度，然后在含 2% 马血清的培养基中培养 7 天以诱导分化。在无血清培养基中饥饿处理后，用促炎细胞因子混合物和 / 或胰岛素处理细胞。去除细胞上清液后，用 1.5 mL 补充的 1 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。然后将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，使用磷酸化和总 IRS1 试剂盒试剂进行 HTRF 检测。

在 3T3-L1 小鼠脂肪细胞上的总 IRS1 检测验证

在含 10% 新生牛血清的培养基中培养 3T3-L1 细胞，然后在含 10% 胎牛血清、胰岛素、地塞米松、IBMX 和微摩尔级噻唑烷二酮的培养基中培养 7 天，以诱导其从成纤维细胞分化为脂肪细胞。在无血清培养基中过夜饥饿后，用 100 nM 胰岛素处理细胞 45 分钟，或用促炎细胞因子混合物处理 30 分钟。去除细胞上清液后，裂解细胞并转移到 384 孔小体积白色微孔板中，使用磷酸化和总 IRS1 试剂盒试剂进行 HTRF 检测（样品由法国尼斯 C3M 研究所 INSERM U1065/UNS 联合实验室 JF Tantis 研究团队友情提供）。

在 MCF-7 人乳腺癌细胞上的总 IRS1 检测验证

将 50,000 个人乳腺癌 MCF-7 细胞接种到 96 孔板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。加入不同浓度的胰岛素，在 37°C 下孵育 45 分钟。去除细胞培养基后，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。然后将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，使用 4 µL HTRF 检测试剂检测磷酸化 IRS1 Ser 312 和总 IRS1。

在 MCF-7 人乳腺癌细胞上的磷酸化 IRS1 检测验证

简化通路

IRS1/PI3K/AKT 信号通路

phospo-pathway

IRS1/PI3K/AKT 信号通路的调控

通路抑制：酪氨酸磷酸化的 IRS-1 正向调节胰岛素信号，而丝氨酸磷酸化通常作为负反馈下调 IRS-1 功能。IRS-1 的丝氨酸磷酸化增加是脂肪组织和骨骼肌中胰岛素抵抗的标志。胰岛素或 IGF-1 与 IR 或 IGF-1R 的细胞外 α 亚基结合，触发受体跨膜 β 亚基的自磷酸化，从而激活受体。IRS1/AKT 通路的激活在维持葡萄糖稳态中起关键作用。AKT 还激活 mTOR，mTOR 介导细胞生长和存活以及蛋白质合成。IRS1 下调是相关的糖尿病标志物，而其过表达与转移性生长和癌症相关。
通路激活：胰岛素或 IGF-1 与 IR 或 IGF-1R 的细胞外 α 亚基（或两者受体的杂合体）结合，触发受体跨膜 β 亚基的自磷酸化。然后，IRS-1 被激活的酪氨酸激酶受体招募，并在多个酪氨酸残基上磷酸化，在膜上形成 PI3K 的停靠位点。随后 PI3K 通路被激活，下游 AKT 发生磷酸化，接着 AS160、GSK3 和 FoxO1 也发生磷酸化，分别导致 GLUT4 转运 / 葡萄糖摄取、糖原合成和糖异生抑制。因此，IRS1/AKT 通路的激活在维持葡萄糖稳态中起关键作用。AKT 还激活 mTOR，mTOR 介导细胞生长和存活以及蛋白质合成。

规格

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64NRSPEY

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