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HTRF C-SRC TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

总 c-Src（总细胞肉瘤病毒癌基因同源物）细胞检测可监测总 c-Src 的表达水平，且可与磷酸化 c-Src 试剂盒搭配使用，作为标准化检测工具。c-Src 蛋白是 Src 激酶家族的成员之一，与该家族其他 10 个成员具有高度的序列同源性。它是一种膜相关非受体酪氨酸激酶，其 Tyr419（酪氨酸 419）位点的自身磷酸化是该蛋白完全激活的标志。在许多人类癌症中，c-Src 激酶存在过表达且活性高度上调的现象，因此成为癌症治疗中极具潜力的靶点。

工作原理

总 c-Src 检测原理

总 c-Src 检测可对细胞裂解液中 c-Src 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot，WB）不同，该检测完全基于微孔板开展，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 c-Src 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 c-Src 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 c-Src 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团会与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中 c-Src 蛋白的浓度直接成正比，且在免清洗检测模式下，可用于评估蛋白的表达水平。

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总 c-Src 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入总 c-Src HTRF（均相时间分辨荧光）检测试剂。该方案能够监测细胞的存活率和融合度。

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总 c-Src 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 c-Src 时，可在同一块微孔板中完成细胞培养、刺激和裂解操作，无需清洗步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

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检测验证

通过人 HEK293 细胞 siRNA 实验验证 HTRF 检测对 c-Src 的特异性

将人胚肾 HEK293 细胞接种并培养 24 小时，随后用 c-Src 小干扰 RNA（siRNA）或阴性对照 siRNA 转染细胞；之后用浓度递增的过氧化氢（H₂O₂）处理细胞，再移除培养基并裂解细胞。将裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入试剂盒试剂。结果显示，与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，经 c-Src siRNA 处理的细胞其 HTRF 信号显著降低（约 75%），这表明该试剂盒对 c-Src 具有特异性，且不会与其他 Src 家族成员发生交叉反应。

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在 A431 癌细胞上通过总 c-Src 检测对比 HTRF 与蛋白质印迹法（WB）的性能

将人 A431 癌细胞接种到 T175 培养瓶中，培养至融合度达到 80%。细胞裂解后，通过离心收集可溶性上清液，用补充后的裂解缓冲液进行系列稀释，随后转移至 384 孔小体积白色微孔板中，最后加入总 c-Src HTRF 检测试剂。取等量裂解液，采用蛋白质印迹法（WB）与 HTRF 检测进行平行对比。结果显示，总 c-Src HTRF 检测的灵敏度是 WB 的 8 倍。

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博舒替尼（Bosutinib）对 HEK293 细胞中 c-Src 活性的抑制作用

将 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。先用浓度递增的博舒替尼处理细胞 30 分钟，再用 20mM 过氧化氢（H₂O₂）刺激细胞 10 分钟；之后移除培养基，加入 50μL 补充后的 3 号裂解缓冲液，在室温（RT）下轻柔振荡，裂解细胞 30 分钟。取 16μL 裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4μL HTRF 磷酸化 c-Src 或总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

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利用 H₂O₂激活人 A431 表皮样癌细胞中的 c-Src

将 A431 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。用浓度递增的过氧化氢（H₂O₂）处理细胞 10 分钟后，移除培养基，加入 50μL 补充后的 3 号裂解缓冲液，在室温（RT）下轻柔振荡，裂解细胞 30 分钟。取 16μL 裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4μL HTRF 磷酸化 c-Src 或总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

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在其他人类癌细胞系中的验证

在经培养处理的 96 孔板中，分别接种人肝癌 HepG2 细胞、人宫颈癌 HeLa 细胞和人乳腺癌 MCF-7 细胞。孵育后，加入 50μL 补充后的 3 号裂解缓冲液，在室温（RT）下轻柔振荡，裂解细胞 30 分钟。取 16μL 裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4μL HTRF 磷酸化 c-Src 或总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

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简化通路

c-Src 简化通路

c-Src 是一种膜相关非受体蛋白酪氨酸激酶，在所有细胞类型中均有广泛表达。该激酶在 Tyr530（酪氨酸 530）位点磷酸化时处于失活状态；而 Tyr530 位点去磷酸化后，再发生 Tyr419（酪氨酸 419）位点的自身磷酸化，是其完全激活的标志性事件。c-Src 主要由受体酪氨酸激酶（RTKs）、整合素和活性氧（ROS）激活，是调控多种信号通路（如 AKT、MAPKs、STATs 和 NF-κB 通路）的关键信号中介分子，可调节细胞增殖、分化、存活、形态、黏附和迁移过程。因此，Src 活性的精确调控对细胞正常生长至关重要。作为一种原癌基因衍生蛋白，c-Src 在许多人类癌症（如乳腺癌、结肠癌和胰腺癌）中存在过表达且活性高度上调的情况，使其成为癌症治疗中极具潜力的靶点。

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规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：HTRF（均相时间分辨荧光）
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 次检测

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货号：64NSRPEH

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