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HTRF TAU TOTAL KIT - 50K PTS

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品牌： Revvity

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概述

总 Tau 细胞检测试剂盒旨在监测 Tau 蛋白的表达水平，包括磷酸化和非磷酸化状态的 Tau 蛋白。该试剂盒与我们的磷酸化 Tau 试剂盒使用相同的缓冲液，能够从单个样本中分析磷酸化蛋白和总蛋白。

TAU（微管相关单位），也称为 MAPT（微管相关蛋白 Tau），是一种在中枢神经系统神经元中大量表达的磷蛋白，参与微管的组装和稳定。

Tau 含有约 85 个潜在的磷酸化位点，这些位点可被多种激酶大量磷酸化，如 CDK5、MAP 激酶或 GSK3β（Tau 的主要激酶）。Tau 过度磷酸化会导致微管断裂、Tau 聚集形成成对螺旋丝或神经原纤维缠结，进而引发细胞死亡。

Tau 过度磷酸化和聚集与多种神经退行性疾病相关，如 Tau 蛋白病、帕金森病和阿尔茨海默病。这两种现象与 β 淀粉样蛋白聚集共同构成了阿尔茨海默病的主要特征。

工作原理

总 Tau 检测原理

总 Tau 检测可定量细胞裂解物中 Tau 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

总 Tau 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 Tau 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 Tau 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入总 Tau HTRF 检测试剂。

该方案能够监测细胞活力和汇合度。

总 Tau 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 Tau 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

不同细胞密度下人 SH-SY5Y 细胞中 Tau 表达水平的检测

将人 SH-SY5Y 细胞以不同密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，移除培养基，加入 50µL 的 1X 补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 总 Tau 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

总 Tau 检测具有高灵敏度和宽动态范围，能够检测到每孔 25,000 个细胞（信噪比 > 5）至 100,000 个 SH-SY5Y 细胞中的 Tau 蛋白。

在人 SH-SY5Y 细胞系中，经 BIO 介导的 GSK3 抑制后 Tau 的表达和磷酸化评估

将人 SH-SY5Y 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，用不同浓度的 GSK3α/β 抑制剂 BIO（6 - 溴靛玉红 - 3 - 肟）处理细胞 1 小时，随后用冈田酸（100nM）处理 2 小时，再用花萼海绵诱癌素 A（100nM）处理 10 分钟。然后移除培养基，加入 50µL 的 1X 补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 Tau（Ser422）或总 Tau 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

BIO 诱导的 GSK3α/β 抑制导致 Tau 的丝氨酸 422 位点磷酸化被完全抑制，而在相同实验条件下，Tau 的表达水平保持稳定。

这些结果表明，HTRF 总 Tau 检测能够检测 Tau 蛋白，且不受其磷酸化状态的影响。

在阿尔茨海默病患者的人脑提取物中检测磷酸化 T181 和总 Tau

人脑阿尔茨海默病患者的脑组织样本按照 Cisbio 技术说明 “在组织上优化您的 HTRF® 细胞信号检测” 进行制备（链接至应用说明）。

使用 BCA 法对脑提取物中的蛋白质含量进行定量，并在系列稀释前将蛋白质浓度调整至 1mg/mL。然后将 16µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 Tau（Thr181）或总 Tau 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

HTRF 磷酸化 Tau（Thr181）和总 Tau 试剂盒在人脑来源的样本中表现出优异性能。

HTRF 总 Tau 检测与蛋白质印迹法的比较

将人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞接种到 T175 培养瓶的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天。然后用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 Tau 检测试剂。取等量裂解物进行蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较。

结果表明，至少在这些实验条件下，HTRF 总 Tau 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

简化通路

Tau 蛋白在阿尔茨海默病通路中的作用
Tau 在阿尔茨海默病的发病机制中起着重要作用。它会发生过度磷酸化并聚集形成细丝，这些细丝可进一步浓缩成神经原纤维缠结。Tau 聚集体可能通过类似朊病毒的方式在细胞间传播，从而加剧病理进程。调控 Tau 过度磷酸化并减少 Tau 聚集的药物是可行的治疗方法。

Tau 蛋白的生理作用是促进微管的组装和稳定。目前已发现 6 种 Tau 亚型，其氨基酸残基数从 352 到 441 不等，这些亚型来自外显子 2、3 和 10 的选择性剪接。最长的 Tau 亚型（Tau-441）含有 85 个潜在的磷酸化位点，其中一半已通过实验证实。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：神经科学
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64NTAUPEY

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