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HTRF STING TOTAL KIT - 10K PTS 总干扰素基因刺激因子蛋白结合检测试剂盒-10,000测试

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概述

总 STING（干扰素基因刺激蛋白）细胞检测试剂盒可监测总 STING 蛋白的表达水平，且能与我们的磷酸化 STING 检测试剂盒配合使用，作为标准化检测工具。该试剂盒与磷酸化 STING 检测试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解液可同时用于分析磷酸化 STING 蛋白和总 STING 蛋白的含量。

当病原体感染细胞，且双链 DNA（dsDNA）与胞质传感器 cGAS（环 GMP-AMP 合成酶）结合后，STING 蛋白会被 TBK1（TANK 结合激酶 1）磷酸化；磷酸化后的 STING 可与 IRF3（干扰素调节因子 3）结合，进而诱导 I 型干扰素的产生。随后，STING 通路会通过自噬介导的 STING 蛋白降解过程被关闭。

在肿瘤免疫学领域，激活 STING 通路已在临床前模型中显示出良好的抗肿瘤效果，因此该通路是治疗人类癌症的潜在治疗策略。

工作原理

总 STING 检测原理

总 STING 检测可对细胞裂解液中 STING 蛋白的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 STING 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 STING 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 STING 蛋白时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团会与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样本中 STING 蛋白的浓度直接成正比，且在免清洗检测模式下，可用于评估 STING 蛋白的表达水平。

phospho-how-it-works-total-sting-assay-principle（图示：总 STING 检测原理）

总 STING 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入总 STING 均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。该方案可监测细胞的存活率和融合度。

phospho-how-it-works-total-sting-2-plate-assay-protocol（图示：总 STING 双板检测方案）

总 STING 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 STING 蛋白时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需清洗步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

phospho-how-it-works-total-sting-1-plate-assay-protocol（图示：总 STING 单板检测方案）

检测验证

2'-3' 环磷酸鸟苷 - 腺苷（2'-3'cGAMP）诱导 THP1 细胞中 STING 蛋白磷酸化

将人 THP1-R232 细胞（购自 Invivogen 公司）以每孔 400,000 个细胞的密度，用 25 微升完全培养基接种到 96 孔板中。用浓度递增的 2'-3'cGAMP（5 微升，作用 4 小时）刺激细胞后，加入 10 微升 4 倍浓度（4X）的补充裂解缓冲液 #4，在室温（RT）下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF® 磷酸化 STING 或总 STING 检测抗体。同时，取 4 微升细胞裂解液，使用相应的 HTRFα- 微管蛋白内参试剂盒分析 α- 微管蛋白（内参蛋白）的表达情况。最后，在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

与其他研究结果一致，2'-3'cGAMP 可显著激活 STING 通路，使 STING 蛋白的磷酸化水平提升 6 倍。且 STING 蛋白磷酸化水平升高的同时，其表达水平会下调（与自噬介导的降解过程一致），而在相同条件下，α- 微管蛋白的表达水平保持稳定。

assay-validation-sting-total-1（图示：总 STING 检测验证 1）

assay-validation-sting-total-2（图示：总 STING 检测验证 2）

HTRF 磷酸化 STING 与总 STING 检测可准确定量激动剂诱导的 STING 调控作用

将 400,000 个 THP1-R232 细胞（购自 Invivogen 公司）用 25 微升完全培养基接种到 96 孔板中。用浓度递增的 2'-3'cGAMP（5 微升，作用 4 小时）刺激细胞后，加入 10 微升 4 倍浓度的补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。取 16 微升裂解液，分别通过 HTRF 检测和蛋白质印迹法（Western Blot）进行平行分析。

通过 HTRF 进行信号定量，可对化合物的作用效果进行准确的统计分析 —— 如下图所示，400 微摩尔（µM）的 cGAMP 可显著降低总 STING 和磷酸化 STING 的水平（所用统计方法：单因素方差分析，P 值＜0.0001）。

assay-validation-sting-total-3（图示：总 STING 检测验证 3）

assay-validation-sting-total-4（图示：总 STING 检测验证 4）

总 STING 细胞检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将人 THP1-R232 细胞系接种到含完全培养基的 T175 培养瓶中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 2 天。随后，用 100 微摩尔 2'-3'cGAMP 刺激细胞 4 小时，再加入 3 毫升补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后，收集可溶性上清液。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 总 STING 检测抗体。取等量裂解液，采用 HTRF 检测与 Western Blot 进行平行对比。

结果显示，使用总 STING 检测试剂盒时，HTRF 检测和 Western Blot 检测均只需每孔 4,000 个细胞即可检测到显著信号。因此，在本实验条件下，两种方法检测总 STING 蛋白的灵敏度相近。

assay-validation-sting-total-5（图示：总 STING 检测验证 5）

简化通路

STING 简化通路

STING（干扰素基因刺激蛋白，STimulator of INterferon Genes）是一种定位于内质网的胞质同源二聚体蛋白，在先天免疫中发挥关键作用。当病原体感染细胞，或细胞凋亡过程中线粒体收缩时，游离的双链 DNA 会与 DNA 传感器 cGAS 结合并将其激活。激活后的 cGAS 会催化生成环二核苷酸 2'-3'cGAMP，该分子随后与 STING 蛋白结合。进而，磷酸化的 STING 会与 TBK1 相互作用，招募并激活 IRF3 二聚体（活性形式）。IRF3 二聚体进入细胞核后，会启动编码干扰素 α/β（IFN-α/β）的基因转录。此外，STING 通路还调控核因子 κB（NF-κB）依赖性炎症细胞因子的表达。作为负反馈调节机制，DNA 激活的 cGAS-STING-TBK1 通路还会通过 p62（SQSTM1）相关的自噬作用触发 STING 蛋白降解，从而关闭 β 干扰素（IFNb）的产生。

phospho-pathway-sting-total-kit-64ntgpeg（图示：STING 简化通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究（Cell Signaling）
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白（Total）
产品类别：试剂盒（Kit）
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶点类别：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶点物种：人（Human）
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：感染性疾病（Infectious Diseases）、肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
单位规格：10,000 次检测（10,000 assay points）

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货号：64NTGPEH

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