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HTRF (H/M) P300 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

基于 p300 细胞的总检测试剂盒能够便捷、准确地检测细胞内总 p300 的水平。该试剂盒与总 CREBBP 试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解液可用于这两个家族成员的分析。

p300（也称为 EP300 或 KAT3B）及其旁系同源物 CREBBP（CREB 结合蛋白，也称为 CBP 或 KAT3A）是关键的转录共激活因子。这些赖氨酸乙酰转移酶（KATs）构成了由两个成员组成的 KAT3 家族。它们通过促进转录机制的组装，以及对核心组蛋白和转录共调节因子上的特定赖氨酸残基进行乙酰化来控制基因转录。p300 和 CREBBP 作为网络 “枢纽”，与 400 多种蛋白质相互作用，调控控制细胞增殖和稳态等多种基本细胞过程的基因表达。

涉及 p300/CREBBP 的突变或染色体易位会导致基因失调，并可能引发多种人类疾病，如癌症、神经退行性疾病和炎症性疾病。最近，已开发出 p300/CREBBP PROTAC 降解剂用于治疗人类癌症。

工作原理
总 p300 检测原理
总 p300 检测可定量细胞裂解物中 p300 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 p300 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白质上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 p300 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质表达的方法。

总 p300 双板检测方案
双板方案包括在裂解前将细胞培养在 96 孔板中，然后在添加 HTRF 总 p300 检测试剂前将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 p300 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 p300 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证
3 种 CREBBP/p300 PROTACs 作用机制的表征
实验采用贴壁细胞的双板检测方案进行。将 HeLa 细胞接种在 96 孔培养板中（每孔 70,000 个细胞，使用完全培养基），在 37°C、5% CO₂条件下培养过夜。次日，用 1 µM 环氧霉素预处理细胞 1 小时，然后再用 3 种剂量的每种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂（PROTAC CBP/p300 Degrader-1、沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 或 dCBP-1）处理 5 小时，同时使用弹头 GNE-781 作为阴性对照（三种 PROTAC 均使用该对照）。用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，然后添加 4 µL HTRF 总 p300 或总 CREBBP 试剂盒检测抗体（HTRF 总 CREBBP 试剂盒，货号 64CREBBPTPEG/Y）。两种检测均孵育过夜后记录 HTRF 信号。通过将 5 µL 相同的裂解物转移到 HTRF 96 孔小体积白色板（货号 66PL96005/025/100）中，然后添加 25 µL ATPlite 1step 检测试剂（ATPlite 1step 发光检测系统，货号 6016736/1/9）来评估细胞活力。在黑暗中孵育 10 分钟后测量发光信号。

处理 5 小时后，三种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂均导致 p300 和 CREBBP 的信号呈剂量依赖性降低，而弹头 GNE-781 未引起任何变化，这与预期一致。如 ATPlite 图表所示，在这些化合物存在的情况下未观察到细胞毒性作用。最后，在蛋白酶体抑制剂环氧霉素存在的情况下，HTRF 信号得以恢复。综上所述，我们的结果明确证明 PROTAC 诱导的 p300/CREBBP 降解是由泛素 - 蛋白酶体系统介导的。

3 种 CREBBP/p300 PROTACs 的剂量效应和时间进程研究
这些实验如前所述在 HeLa 细胞上进行，不同之处在于用递增浓度的每种 CREBBP/p300 PROTAC（或弹头 GNE-781）处理细胞 4 小时或 20 小时。如前所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 p300 和总 CREBBP，并使用 ATPlite 1step 发光试剂盒测量细胞活力。

三种 PROTAC 均诱导 p300 和 CREBBP 的剂量依赖性降解，而弹头 GNE-781 则没有。这些化合物对两种蛋白质表现出相似的作用（例如效力和动力学）。两种处理时间后，三种降解剂的排名相同，沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 的效力分别是 PROTAC CBP/p300 Degrader-1 的 4 倍和 dCBP-1 的 10 倍（基于 DC50 值）。处理 20 小时后，PROTAC CBP/p300 Degrader-1 和 dCBP-1 的效力显著提高（提高 2.5 至 5 倍），沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 的降解效率也从 65% 提高到 80%。值得注意的是，即使处理 20 小时，这些化合物也没有引起明显的细胞毒性作用（ATPlite 1step 检测，数据未显示）。

总 p300 和总 CREBBP 检测特异性的验证
将 HeLa 细胞接种在 96 孔培养板中（总 p300 检测每孔 12,500 个细胞，总 CREBBP 检测每孔 50,000 个细胞），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下培养过夜。次日，用特异性靶向人 p300 或其旁系同源物人 CREBBP 的 ON-TARGETplus SMARTPool siRNA 转染细胞，同时使用非靶向 siRNA 作为阴性对照。与 siRNA 孵育 24 小时后，更换培养基再孵育 24 小时，然后用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞。细胞裂解后，如第一部分所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 p300 和总 CREBBP，同时使用 ATPlite 1step 发光试剂盒测量细胞活力。

siRNA 实验表明，HTRF 总 p300 和总 CREBBP 试剂盒均能特异性测量目标蛋白质，而不会识别另一个家族成员。发现用 p300 siRNA 处理使总 p300 检测的信号降低 86%，而 CREBBP 基因的沉默并未导致该检测的信号降低。相反，用 CREBBP siRNA 孵育使总 CREBBP 检测的信号降低 70%，而 p300 的敲低并未导致该检测的信号降低。在 p300 和 CREBBP siRNA 存在的情况下，ATPlite 发光信号保持相当稳定，表明 HTRF 信号的降低与细胞毒性作用无关。

各种人和小鼠细胞系中总 p300 水平的评估
实验采用贴壁细胞的双板检测方案进行。将人细胞系 HeLa、SH-SY5Y、MCF7、A549 和 A431，以及小鼠细胞系 NIH-3T3 和 Neuro-2a 接种在 96 孔培养板中（每孔 100,000 个细胞，使用完全培养基），在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。次日，用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，然后添加 4 µL HTRF 总 p300 试剂盒检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 p300 试剂盒与人源和小鼠源细胞模型兼容，能有效检测不同蛋白质表达水平的细胞系中的 p300。

HTRF 总 p300 检测与蛋白质印迹法的比较
将 HeLa 细胞接种在 T175 培养瓶中，在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养至约 90% 汇合度。然后用 3 mL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，并使用补充的裂解缓冲液对裂解物进行系列稀释。为检测总 p300，将每种稀释液的 16 µL 转移到小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，并添加 4 µL HTRF 总 p300 检测试剂。将等量的裂解物上样到凝胶上，与蛋白质印迹法进行平行比较。

使用 HTRF 总 p300 检测时，每孔 1,000 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 8,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总 p300 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 8 倍。

简化通路
CREBBP/p300 信号通路
转录共激活因子 CREBBP 和 p300 通过促进转录机制的组装，以及对核心组蛋白和其他转录调节因子（如转录因子 c-Myc、p53 和 FoxO1）进行乙酰化来调控基因表达。

CREBBP 和 p300 是许多由细胞内或细胞外信号激活的重要信号通路的核心。它们调控生长因子和激素信号传导，如由核激素受体 AR（雄激素受体）和 ER（雌激素受体）介导的信号传导。其他信号例子包括缺氧、细胞应激（涉及 MAP 激酶 p38、JNK 和 ERK）、高葡萄糖、GPCR 激动剂（诱导 cAMP 信号传导）和细胞因子（由 JAK/STAT 通路介导）。TLR/IRF-3 通路也受 CREBBP/p300 调控，以控制先天免疫反应。CREBBP 和 p300 都是 BRD4 占据位点的组蛋白乙酰化（例如 H3K27ac）以及 BRD4 在基因启动子和增强子上的结合以调控相关基因转录所必需的。

所有这些通路最终都利用细胞核中的 CREBBP 和 p300 作为下游效应器，来控制关键的细胞功能，如细胞周期调控和分化、胚胎发育和稳态。

规格

其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
裂解缓冲液兼容性
1 号裂解缓冲液
2 号裂解缓冲液
3 号裂解缓冲液
4 号裂解缓冲液
分子修饰
总（蛋白）
产品类别
试剂盒
样品体积
16 µL
运输条件
干冰运输
目标类别
磷蛋白
目标物种
人
小鼠
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格
500 个检测点

没有数据

货号：64P300TPEY

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