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HTRF P53 P-S15 KIT - 10K PTS

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概述

这款基于细胞的均相时间分辨荧光检测试剂盒（HTRF），可便捷、准确地定量检测 Ser15 位点磷酸化的 p53 蛋白。p53 蛋白因在维护基因组完整性中发挥关键作用，被称为 “基因组的守护者”。p53 具有多种抗癌功能机制，通过调控各类靶基因的表达，可影响细胞凋亡、衰老、细胞周期调控、生长停滞、基因组稳定性、血管生成抑制及代谢变化等过程。

工作原理

磷酸化 p53（Ser15）检测原理

磷酸化 p53（Ser15）检测可特异性检测 Ser15 位点磷酸化的 p53 蛋白。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需使用凝胶、无需开展电泳或转膜操作。
该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。其中，第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白（不受蛋白磷酸化状态影响）。当蛋白发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移信号（FRET）。该信号强度与样本中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且在免清洗检测模式下，可用于评估蛋白的磷酸化状态。

phospho-p53-ser15-assay-principle（图示：磷酸化 p53（Ser15）检测原理）

磷酸化 p53（Ser15）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入磷酸化 p53（Ser15）HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-p53-ser15-2-plate-assay-protocol（图示：磷酸化 p53（Ser15）双板检测方案）

磷酸化 p53（Ser15）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 p53（Ser15）时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需清洗步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

phospho-p53-ser15-1-plate-assay-protocol（图示：磷酸化 p53（Ser15）单板检测方案）

检测验证

基于人源 MCF-7 细胞的磷酸化 p53 与总 p53 检测：HTRF 法与蛋白质印迹法（WB）比较

将人源 MCF-7 细胞以每孔 10⁶个细胞的密度接种于 6 孔板，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。经紫外线处理 5 分钟（2.1J/cm²）后，加入 200 微升裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡孵育 30 分钟以裂解细胞。用补充后的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，再加入 4 微升磷酸化 p53（Ser15）HTRF 检测试剂。取等量裂解液，采用蛋白质印迹法与 HTRF 法进行平行对比检测。结果显示，两种 p53 蛋白的 HTRF 检测灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍。

assay-validation-p53-phospho-s15-1（图示：磷酸化 p53（Ser15）检测验证 1）

经新制癌菌素处理的 MCF-7 乳腺癌细胞验证

将人源 MCF-7 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种于 96 孔板，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。用浓度递增的新制癌菌素处理细胞 45 分钟后，移除培养基，加入 50 微升裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡孵育 30 分钟以裂解细胞。取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，再加入 4 微升磷酸化 p53（Ser15）或总 p53 HTRF 检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

assay-validation-p53-phospho-s15-2（图示：磷酸化 p53（Ser15）检测验证 2）

经依托泊苷（凋亡诱导剂）处理的 MCF-7 乳腺癌细胞验证

将人源 MCF-7 细胞以每孔 200,000 个细胞的密度接种于 96 孔板，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。用浓度递增的依托泊苷处理细胞 3 小时后，移除培养基，加入 50 微升裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡孵育 30 分钟以裂解细胞。取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，再加入 4 微升磷酸化 p53（Ser15）或总 p53 HTRF 检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

assay-validation-p53-phospho-s15-3（图示：磷酸化 p53（Ser15）检测验证 3）

简化通路

p53 的功能与调控

p53 可被多种应激信号激活，包括但不限于 DNA 损伤、氧化应激、渗透压休克、核糖核苷酸耗竭及癌基因表达失调。在应对这些应激时，p53 会发生大量翻译后修饰，包括磷酸化和乙酰化。p53 的磷酸化主要发生在 N 端的 Ser15 位点，该修饰会降低 p53 与其负调控因子 —— 癌蛋白 MDM2 的相互作用。MDM2 通过将 p53 靶向泛素化并介导其蛋白酶体降解，从而抑制 p53 的积累；而 Ser15 位点的磷酸化会削弱 MDM2 与 p53 的结合能力，进而在 DNA 损伤应答中促进 p53 的积累与激活。

phospho-pathway-p53-64p53peg（图示：p53 功能与调控简化通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人
技术平台：TR-FRET
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 次检测

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货号：64P53PEH

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