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HTRF (H) PINK1 TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

总 PINK1 检测试剂盒（Total PINK1 assay）旨在监测细胞内 PINK1 蛋白的水平。

PINK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶（ser/thr kinase），在 PINK1-Parkin 介导的线粒体自噬中发挥关键作用。该信号通路对清除线粒体毒性产物、维持细胞内稳态至关重要。此信号通路的调控异常与神经退行性疾病相关，其中以帕金森病最为典型。

在线粒体受损 depolarization（去极化）时，PINK1 会在线粒体外膜积累，并通过磷酸化两种底物（Parkin 的类泛素结构域以及 Ser65 位点的泛素链）激活 PINK1-Parkin 通路。Parkin 是一种泛素连接酶 E3，可将泛素偶联到受损线粒体蛋白上，进而引发线粒体降解。经 PINK1/Parkin 依赖途径放大的泛素功能，会作为信号介导受损线粒体的包裹与降解（即线粒体自噬）。

使用解偶联剂（如 CCCP 和缬氨霉素）诱导线粒体去极化，会导致 PINK1 在线粒体外膜积累，并触发 Ser65 位点磷酸化泛素（PhosphoS65-Ubiquitin）的产生。

工作原理

总 PINK1 检测原理

HTRF 总 PINK1 检测可对细胞裂解液中 PINK1 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需使用凝胶、无需开展电泳或转膜操作。
总 PINK1 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 PINK1 蛋白上的特定表位具有高特异性。当细胞提取物中存在 PINK1 时，加入这两种抗体偶联物会使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 PINK1 蛋白的浓度直接成正比，且在免清洗检测模式下，可用于评估 PINK1 蛋白的表达水平。

assay-principle-total-pink1-64pinktpeg（图示：总 PINK1 检测原理）

总 PINK1 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入总 PINK1 HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

assay-protocol-how-it-works-total-pink1-64pinktpeg（图示：总 PINK1 双板检测方案）

总 PINK1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 PINK1 时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需清洗步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

assay-protocol-how-it-works-total-pink1-64pinktpeg（图示：总 PINK1 单板检测方案）

检测验证

CCCP 诱导 SH-SY5Y 和 PC3 细胞系的线粒体自噬

将 SH-SY5Y 细胞（神经母细胞瘤细胞）或 PC3 细胞（前列腺腺癌细胞）以每孔 200,000 个细胞的密度接种于 96 孔板，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用浓度递增的线粒体解偶联剂 —— 羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理细胞。孵育 6 小时后，移除细胞培养基，向每孔加入 50 微升（µL）补充后的 1 号裂解缓冲液（1×）。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，再加入 4 微升总 PINK1 HTRF 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

同时，取 4 微升 1:5 稀释后的裂解液，采用 HTRFα- 微管蛋白内参检测试剂盒（64ATUBPEG/H）进行检测，作为标准化参照工具。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示，在两种细胞系中，CCCP 均能以剂量依赖性方式诱导 PINK1 蛋白水平升高。这表明 CCCP 可促进 PINK1 积累，且其半数有效浓度（EC50）符合预期，处于低微摩尔（µM）范围。

assay-validation-total-pink1-64pinktpeg（图示：总 PINK1 检测验证 1）

assay-validation-total-pink1-activator-cccp-02（图示：总 PINK1 检测验证 2：CCCP 诱导作用）

缬氨霉素（Valinomycin）诱导 SH-SY5Y 和 PC3 细胞系的线粒体自噬

将 SH-SY5Y 细胞（神经母细胞瘤细胞）或 PC3 细胞（前列腺腺癌细胞）以每孔 200,000 个细胞的密度接种于 96 孔板，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用浓度递增的线粒体解偶联剂 —— 缬氨霉素处理细胞。孵育 4 小时后，移除细胞培养基，向每孔加入 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液（1×）。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，再加入 4 微升总 PINK1 HTRF 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

同时，取 4 微升 1:5 稀释后的裂解液，采用 HTRFα- 微管蛋白内参检测试剂盒（64ATUBPEG/H）进行检测，作为标准化参照工具。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示，在两种细胞系中，缬氨霉素均能以剂量依赖性方式诱导 PINK1 蛋白水平升高。这表明缬氨霉素可促进 PINK1 积累，且其半数有效浓度（EC50）符合预期，处于纳摩尔（nM）范围。

assay-validation-total-pink1-activator-valinomycin-01（图示：总 PINK1 检测验证 3：缬氨霉素诱导作用 1）

assay-validation-total-pink1-activator-valinomycin-02（图示：总 PINK1 检测验证 4：缬氨霉素诱导作用 2）

简化通路

PINK1 信号通路

在去极化诱导的线粒体自噬过程中，PINK1（PTEN 诱导激酶 1）会在受损的线粒体外膜（OMM）积累，并通过二聚化和自身磷酸化被激活。激活后的 PINK1 会磷酸化泛素连接酶 Parkin（磷酸化位点为其类泛素结构域的 Ser65），同时也会磷酸化线粒体外膜上的泛素化底物。其中，TOM20（线粒体外膜转运酶 20）被泛素化后会被送往蛋白酶体降解。PINK1/Parkin 通路的激活会导致 PINK1 蛋白和 Ser65 位点磷酸化泛素（phospho-Ubiquitin）积累，同时使 TOM20 水平降低。

PINK1/Parkin 介导的线粒体自噬可清除线粒体毒性产物，从而防止神经元丢失。

pathway-total-PINK1-64pinktpeg-64pinktpeh-64pinktpey.svg（图示：PINK1 信号通路简化图）

规格参数

其他规格参数

应用领域（Application）：细胞信号通路研究（Cell Signaling）
品牌（Brand）：HTRF
检测方式（Detection Modality）：HTRF
裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型（Molecular Modification）：总蛋白（Total）
产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）：16 微升（µL）
运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶点类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶点物种（Target Species）：人（Human）
技术平台（Technology）：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格（Unit Size）：500 次检测（500 assay points）

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货号：64PINKTPEG

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