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HTRF (H/M) RAB10 P-T73 KIT - 500 PTS HTRF磷酸化大鼠肉瘤相关蛋白10（苏氨酸73）检测试剂盒，500测试

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概述

RAS 相关蛋白 Rab10（RAB10）属于小 GTP 酶的 RAS 超家族。Rab10 是细胞内膜转运的关键调控因子，可调控膜结合细胞器与囊泡的生物发生、转运、锚定及融合过程。富含亮氨酸重复序列激酶 2（LRRK2）介导的磷酸化作用，可能导致 Rab10 调控的内溶酶体转运通路功能异常，进而参与神经退行性疾病的发生。Rab10 与阿尔茨海默病及帕金森病相关。

工作原理

Rab10 磷酸化均相时间分辨荧光检测原理

Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化检测可对苏氨酸 73 位点磷酸化的 Rab10 进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估蛋白质的磷酸化状态。

phospho-how-it-works-rab10-phospho-assay-principle-01（图示：Rab10 磷酸化检测原理）

Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化均相时间分辨荧光检测试剂。

该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-how-it-works-rab10-total-assay-protocol-01（图示：Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化双板检测方案）

Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。

该专为高通量筛选设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-how-it-works-rab10-phospho-assay-protocol-02（图示：Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化单板检测方案）

检测验证

A549 和 Raw264.7 细胞系中 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化的抑制检测

将 A549 细胞和 Raw264.7 细胞以每孔 200,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。随后用浓度递增的 MLi-2 处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 1.5 小时，接着用 100 微摩尔的氯喹刺激细胞 3 小时。

细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化均相时间分辨荧光检测试剂，以检测磷酸化蛋白水平。同时，取 4 微升裂解液（补充 8 微升裂解缓冲液）转移至另一微孔板，先加入 2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 A、2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 B，再加入 4 微升总 Rab10 检测试剂，以检测总 Rab10 蛋白水平。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：MLi-2 处理以剂量依赖性方式抑制 Rab10（苏氨酸 73 位点）的磷酸化，而 Rab10 的表达水平保持稳定。

assay-validation-rab10-phospho-pharmaco-1-1（图示：Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化药物验证 1-1）

assay-validation-rab10-phospho-pharmaco-1-2（图示：Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化药物验证 1-2）

小干扰 RNA 介导的 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化下调检测

将 A549 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。随后用 Rab10 特异性小干扰 RNA 及阴性对照小干扰 RNA 转染细胞。孵育 48 小时后，用 500 微摩尔氯喹刺激细胞 5 小时，再用补充后的裂解缓冲液裂解细胞。取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化均相时间分辨荧光检测抗体。另外，取 4 微升裂解液（补充 12 微升 11 号稀释液）转移至该微孔板，使用 GAPDH 内参细胞检测试剂盒监测 GAPDH 水平。孵育过夜后，记录两种试剂盒的均相时间分辨荧光信号。

结果显示：与阴性对照小干扰 RNA 转染组相比，Rab10 小干扰 RNA 转染组的细胞信号降低 64%；在所有测试条件下，所检测的 GAPDH 水平均保持不变。该数据表明，Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化均相时间分辨荧光检测试剂盒对磷酸化 Rab10 蛋白的检测具有特异性。

assay-validation-rab10-phospho-pharmaco-2-1（图示：Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化药物验证 2-1）

assay-validation-rab10-phospho-pharmaco-2-2（图示：Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化药物验证 2-2）

多种细胞系中 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化的检测

将 A549 细胞、1321-N1 细胞和 Raw264.7 细胞以每孔 200,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用或不用 500 微摩尔氯喹刺激细胞 5 小时，再用补充后的裂解缓冲液裂解细胞。随后取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化均相时间分辨荧光检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化均相时间分辨荧光检测可在经氯喹刺激或未刺激的多种细胞模型中有效检测 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化。

assay-validation-rab10-phospho-pharmaco-3（图示：Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化药物验证 3）

Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的比较

将 A549 细胞接种到 T175 培养瓶中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养。孵育 72 小时后，用氯喹刺激细胞 5 小时，随后加入 3 毫升补充后的 3 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化均相时间分辨荧光检测试剂。取等量裂解液，通过蛋白质印迹法与均相时间分辨荧光法进行平行对比检测。

结果显示：蛋白质印迹法与均相时间分辨荧光法的平行对比表明，至少在此实验条件下，Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化均相时间分辨荧光检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

assay-validation-rab10-phospho-pharmaco-4（图示：Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化药物验证 4）

简化通路

简化的 Rab10 信号通路

富含亮氨酸重复序列激酶 2（LRRK2）是常染色体显性遗传帕金森病的主要致病基因，作为一种蛋白激酶，它可磷酸化包括 Rab10 在内的部分 Rab GTP 酶。Rab29 可介导 LRRK2 向细胞器膜的募集，并增强 LRRK2 的酶活性（通过丝氨酸 1292 自身磷酸化监测）。LRRK2 可诱导 Rab10（苏氨酸 73 位点）磷酸化，而磷酸化的 Rab10 进而调控纤毛发生、囊泡转运、膜转运及融合过程。

phospho-pathway-rab10-phospho-64rabt73peg（图示：Rab10 磷酸化信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：3 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移
单位规格：500 次检测

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货号：64RABT73PEG

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