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HTRF RB P-S780 KIT - 10K PTS 磷酸化RB(S780)试剂盒- 10,000测试

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概述

这款基于细胞的均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂盒，可便捷且准确地定量检测丝氨酸 780（Ser780）位点磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）。Rb 属于口袋蛋白家族，是一种肿瘤抑制因子，能够调控细胞周期进程。具有活性的去磷酸化 Rb 会与 E2F 转录因子相互作用并抑制其转录活性，从而阻止细胞周期从 G0 期向 G1 期转换及后续进程。当存在有丝分裂信号时，周期蛋白 D - 细胞周期蛋白依赖性激酶 4/6（cyclin D-CDK4/6）会首先对 Rb 进行磷酸化，随后周期蛋白 E - 细胞周期蛋白依赖性激酶 2（cyclin E-CDK2）继续对其磷酸化，使 Rb 失活；失活后的 Rb 会释放出细胞周期进程所需的 E2F 转录因子。

工作原理

磷酸化 Rb（Ser780 位点）检测原理

磷酸化 Rb（Ser780 位点）检测可对 Ser780 位点发生磷酸化的 Rb 进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

磷酸化 Rb（Ser780 位点）检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序；第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由这两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估蛋白质的磷酸化状态。

phospho-how-it-works-phospho-rb-ser780-assay-kit-principle（图示：磷酸化 Rb（Ser780 位点）检测原理）

磷酸化 Rb（Ser780 位点）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至小体积检测板（均相时间分辨荧光 384 孔小体积板或 96 孔小体积板）后，加入均相时间分辨荧光磷酸化 Rb（Ser780 位点）检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-rb-ser780-cellular-assay-2-plate-assay-protocol（图示：磷酸化 Rb（Ser780 位点）双板检测方案）

磷酸化 Rb（Ser780 位点）单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测磷酸化 Rb（Ser780 位点）时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-rb-ser780-1-plate-assay-protocol（图示：磷酸化 Rb（Ser780 位点）单板检测方案）

检测验证

在 HCT-116 细胞中，CDK4/CDK6 抑制剂帕博西尼（Palbociclib）可有效抑制 Rb Ser780 位点的磷酸化

将 HCT-116 细胞用 50 微升完全培养基，以每孔 50,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育。6 小时后，加入浓度递增的帕博西尼（额外添加 50 微升），处理 19 小时。

移除培养基后，加入 50 微升补充后的裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟；取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升预混合的均相时间分辨荧光磷酸化 Rb（Ser780 位点）或总 Rb 检测试剂。孵育 4 小时后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK4 和 CDK6）抑制剂帕博西尼，会导致 Rb Ser780 位点的磷酸化水平显著降低，同时 Rb 总蛋白量也会下降（该结果与 Liu 等人 2017 年发表在《Plos》期刊的研究一致）。

assay-validation-rb-phospho-s780-1（图示：磷酸化 Rb（Ser780 位点）检测验证 1）

磷酸化 Rb 细胞检测对人源和鼠源细胞系的验证

将 NIH 3T3 细胞、C2C12 细胞和 HCT116 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，移除细胞培养基，向细胞中加入 50 微升裂解缓冲液，轻柔振荡裂解 30 分钟。取 16 微升样本转移至 384 孔小体积板，随后分别加入 4 微升三种 Rb 均相时间分辨荧光检测试剂。孵育 4 小时后，记录信号。

结果显示：两种 Rb 磷酸化均相时间分辨荧光检测均兼容鼠源模型。

assay-validation-rb-phospho-s780-2（图示：磷酸化 Rb（Ser780 位点）检测验证 2）

人源 HCT116 细胞中磷酸化 Rb（Ser780 位点）均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将人源 HCT116 细胞在 T175 培养瓶中，于 37°C、5% 二氧化碳条件下培养。当细胞融合度达到 80% 时，裂解细胞并通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，最终加入 Rb Ser780 位点磷酸化细胞检测试剂盒试剂。

平行对比结果显示：磷酸化 Rb 均相时间分辨荧光检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 9 倍。

assay-validation-rb-phospho-s780-3（图示：磷酸化 Rb（Ser780 位点）检测与蛋白质印迹法比较验证）

简化通路

细胞分裂周期中的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）

分子量为 110 千道尔顿（kDa）的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）属于口袋蛋白家族，该家族还包括 p107 和 p130 蛋白。

Rb 作为肿瘤抑制因子，可调控细胞周期进程。当 Rb 发生失活突变时，会引发视网膜母细胞瘤 —— 此时视网膜细胞无法正常更新，且会暴露于高剂量致突变紫外线辐射下。

在无有丝分裂信号时，具有活性的去磷酸化 Rb 会结合并抑制 E2F 转录因子，而 E2F 是细胞进入 S 期（DNA 合成期）所必需的。通过维持 E2F 的失活状态，Rb 可使细胞停留在 G1 期，阻止细胞周期继续推进。

当存在有丝分裂信号时，Rb 会被 cyclin D-CDK4/6 依次磷酸化，随后再被 cyclin E-CDK2 磷酸化，最终失活。这一磷酸化过程会促使 E2F 转录因子释放。

最终，E2F 会激活多种基因的转录，如周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）、胸苷激酶（Thymidine kinase）和增殖细胞核抗原（PCNA）等 —— 这些基因在 DNA 合成、复制及细胞分裂中发挥关键作用。

phospho-pathway-rb-phopsho-s780-63adk104peg（图示：Rb（Ser780 位点）磷酸化信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：均相时间分辨荧光（HTRF）
检测方式：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：10000 次检测

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货号：64RBS780PEH

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