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HTRF RB P-S780 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷、准确地定量丝氨酸 780（Ser780）位点磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein，Rb）。Rb 属于口袋蛋白家族，作为肿瘤抑制因子发挥作用，调控细胞周期进程。活性状态的低磷酸化 Rb 会与 E2F 转录因子相互作用并抑制其转录活性，从而阻止细胞周期从 G0/G1 期过渡和进展。在有丝分裂信号存在时，周期蛋白 D - 细胞周期蛋白依赖性激酶 4/6（cyclin D-CDK4/6），随后是周期蛋白 E - 细胞周期蛋白依赖性激酶 2（cyclin E-CDK2），会依次磷酸化 Rb 并使其失活，释放细胞周期进展所需的 E2F 转录因子。

工作原理

磷酸化 Rb（Ser780）检测原理

磷酸化 Rb（Ser780）检测用于测量 Ser780 位点磷酸化的 Rb。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 Rb（Ser780）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 Rb（Ser780）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至小体积检测板（HTRF 384 孔小体积板或 96 孔小体积板均可）中，再加入 HTRF 磷酸化 Rb（Ser780）检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 Rb（Ser780）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 Rb（Ser780）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在 HCT-116 细胞中，CDK4/CDK6 抑制剂帕博西尼（Palbociclib）可有效抑制视网膜母细胞瘤蛋白 Ser780 位点的磷酸化

将 HCT-116 细胞以 50 µL 的体积接种到 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。6 小时后，用不同浓度的帕博西尼处理细胞（额外加入 50 µL 体积，处理 19 小时）。

移除培养基后，用 50 µL 补充的裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 磷酸化 Rb（Ser780）或总 Rb 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

用细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk4 和 Cdk6）抑制剂帕博西尼处理后，Rb 的 Ser780 位点磷酸化水平显著降低，同时蛋白质总量也减少（如 Liu 等人在 2017 年《Plos》期刊中所报道）。

在人类和小鼠细胞系中进行的磷酸化 Rb 细胞检测验证

将 NIH 3T3、C2C12 和 HTC116 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，移除细胞培养基，向细胞中加入 50 µL 裂解缓冲液。轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16 µL 样品转移至 384 孔小体积板中，然后分别加入 4 µL 三种 HTRF Rb 检测试剂。4 小时后记录信号。

两种 HTRF 磷酸化检测均与小鼠模型兼容。

在人类 HCT116 细胞上使用磷酸化 Rb Ser780 细胞检测进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将人类 HCT116 细胞在 T175 培养瓶中于 5% CO₂、37°C 条件下培养。当细胞汇合度达到 80% 时，裂解细胞并通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，最后加入磷酸化 Ser780 Rb 细胞试剂盒试剂。平行比较显示，HTRF 磷酸化检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 9 倍。

简化通路

细胞分裂周期中的视网膜母细胞瘤蛋白
110 kDa 的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）属于口袋蛋白家族，该家族还包括 p107 和 p130。

Rb 作为肿瘤抑制因子，调控细胞周期进程。

使该蛋白失活的突变会导致视网膜母细胞瘤的发生，此时视网膜细胞无法更新，且会受到高强度诱变紫外线的照射。

在没有有丝分裂信号时，活性状态的低磷酸化 Rb 会结合并抑制进入 S 期所需的 E2F 转录因子。

通过使 E2F 保持失活状态，Rb 将细胞维持在 G1 期，阻止细胞周期进展。

在有丝分裂信号存在时，Rb 会被 cyclin D-CDK4/6 依次磷酸化并失活，随后被 cyclin E-CDK2 磷酸化。这一磷酸化事件会促使 E2F 转录因子释放。

最终，E2F 激活多种基因的转录，如周期蛋白、CDK、胸苷激酶或 PCNA 等，这些基因在 DNA 合成与复制以及细胞分裂中发挥着重要作用。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64RBS780PEY

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