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HTRF RET P-PAN KIT - 500 PTS 磷酸化基因重排蛋白检测试剂盒 –500测试

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概述

基于细胞的均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）检测试剂盒，可便捷且准确地检测酪氨酸残基上发生磷酸化的 RET 蛋白，能同时定量 RET 的短亚型和长亚型。

原癌基因 RET（转染重排基因），又称 c-Ret，是一种受体酪氨酸激酶，主要以两种亚型存在，分别含 1072 个和 1114 个氨基酸。RET 可被胶质细胞源性神经营养因子家族配体（GFL）激活，激活后会发生二聚化，并在细胞内酪氨酸残基上发生自身磷酸化。RET 对神经系统及其他多种组织的发育至关重要，在多种人类癌症中已检测到 RET 基因改变，因此研发高选择性、高效能的 RET 激酶抑制剂对于治疗 RET 基因改变相关癌症具有重要意义。近年来，RET 还被发现与神经退行性疾病相关。

工作原理

RET 磷酸化（泛特异性）检测原理

RET 磷酸化（泛特异性）检测可对酪氨酸残基发生磷酸化的 RET 蛋白进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

该检测采用两种抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合磷酸化酪氨酸残基；第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态，特异性识别 RET 蛋白。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由这两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估蛋白质的磷酸化状态。

phospho-how-it-works-ret-pan-assay-principle（图示：RET 磷酸化（泛特异性）检测原理）

RET 磷酸化（泛特异性）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入 RET 磷酸化（泛特异性）均相时间分辨荧光检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-how-it-works-ret-pan-assay-protocol-1（图示：RET 磷酸化（泛特异性）双板检测方案）

RET 磷酸化（泛特异性）单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测 RET 磷酸化（泛特异性）时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该专为高通量筛选设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-how-it-works-ret-pan-assay-protocol-2（图示：RET 磷酸化（泛特异性）单板检测方案）

检测验证

小鼠神经母细胞瘤 Neuro-2a 细胞中 RET 磷酸化的诱导

将小鼠神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a 以每孔 50,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的过钒酸盐处理细胞 15 分钟，实验分为两组：一组不加小鼠胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），另一组加入 100 纳克 / 毫升的小鼠 GDNF。处理结束后，加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：在未加入过钒酸盐的情况下，可观察到 GDNF 诱导的 RET 磷酸化；加入 6.25 微摩尔和 12.5 微摩尔过钒酸盐（可抑制酪氨酸去磷酸化）后，检测效果显著提升；单独使用 50 微摩尔过钒酸盐时，RET 磷酸化水平达到最高。

RET 总蛋白检测结果显示，在所有实验条件下，RET 总蛋白水平保持稳定，这表明高剂量过钒酸盐未导致细胞脱落。

assay-validation-ret-pan-1（图示：RET 磷酸化（泛特异性）检测验证 1）
assay-validation-ret-pan-2（图示：RET 磷酸化（泛特异性）检测验证 2）

小鼠神经母细胞瘤 Neuro-2a 细胞中 RET 磷酸化的抑制

将小鼠神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a 以每孔 100,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的普拉替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 微摩尔过钒酸盐。加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：RET 激酶抑制剂普拉替尼以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，但对 RET 受体的表达水平无影响。

assay-validation-ret-pan-3（图示：RET 磷酸化（泛特异性）检测验证 3）

人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中 RET 磷酸化的抑制

将人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 以每孔 100,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的普拉替尼和塞普替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 微摩尔过钒酸盐。加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：两种 RET 激酶抑制剂均以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，但对 RET 受体的表达水平无影响。

assay-validation-ret-pan-4（图示：RET 磷酸化（泛特异性）检测验证 4）
assay-validation-ret-pan-5（图示：RET 磷酸化（泛特异性）检测验证 5）

人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 中 RET 磷酸化的抑制

将人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 以每孔 50,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的普拉替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 微摩尔过钒酸盐。加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：RET 激酶抑制剂普拉替尼以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，但对 RET 受体的表达水平无显著影响。

assay-validation-ret-pan-6（图示：RET 磷酸化（泛特异性）检测验证 6）

简化通路

RET 信号通路

RET 可被胶质细胞源性神经营养因子家族配体（GFL）激活，该家族配体包括胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经营养素（NRTN）、肌萎缩相关蛋白（ARTN）和 Persephin（PSPN）。配体与 GDNF 家族受体 α 共受体（GFRα1/2/3/4）结合后，会触发其与 RET 形成复合物，进而导致 RET 发生二聚化，并在细胞内多个酪氨酸残基上发生自身磷酸化。磷酸化的酪氨酸残基可作为多种衔接蛋白的结合位点，这些衔接蛋白会激活下游信号通路（如 MAPK、PI3K/AKT、STAT3 等），而这些通路对于细胞存活、分化、增殖和迁移至关重要。

phospho-pathway-ret-pan（图示：RET 磷酸化（泛特异性）相关信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
自动化兼容性：是
品牌：均相时间分辨荧光
检测方式：均相时间分辨荧光
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 次检测

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货号：64RETYPEG

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