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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可方便、准确地检测磷酸化的 RIPK1（丝氨酸 166 位点）。RIPK1（受体相互作用丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 1，也称为 RIP1 或 RIP）是凋亡和坏死性细胞死亡以及 TNFR1 和其他受体相关炎症通路的关键调节因子。丝氨酸 166 位点的自身磷酸化被认为是 RIPK3/MLKL 依赖性坏死性凋亡启动的生物标志物。坏死性凋亡是一种程序性坏死性细胞死亡途径，也称为 “炎症性细胞死亡”，与包括炎症性疾病、神经退行性疾病以及癌症在内的多种病理状态密切相关。因此，它已成为制药行业中一个重要的药物靶点。治疗策略包括开发特异性小分子激酶抑制剂，如著名的 Necrostatin-1 和 Necrostatin-1s。

工作原理

磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）检测原理

磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）检测用于测量在丝氨酸 166 位点发生磷酸化的 RIPK1。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测过程使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利手段。

磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板中，之后添加磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

RT-112/84 细胞中 RIPK1 激酶活性的调节

将人膀胱癌细胞系 RT-112/84 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。在 RIPK1 激活实验中，先用 25μM Z-VAD（泛半胱天冬酶抑制剂）预处理细胞 30 分钟，然后同时加入 100nM SM-164（cIAP1/2 抑制剂）和不同浓度的人 TNF-α，处理 6 小时。在 RIPK1 抑制实验中，先用 25μM Z-VAD 预处理细胞 20 分钟，然后加入递增剂量的 Necrostatin-1s。10 分钟后，加入含有 100ng/mL TNF-α 和 100nM SM-164 的预混液，处理 6 小时。处理后，用 50μL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测时，将 16μL 细胞裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）或总 RIPK1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 SM-164（阻断细胞存活）和 Z-VAD（阻断细胞凋亡）存在的情况下，TNF-α 以剂量依赖性方式诱导 RIPK1 在丝氨酸 166 位点的自身磷酸化，这表明坏死性凋亡通路被激活。与文献（1,2）一致，总 RIPK1 水平呈反向调节，这是由于 RIPK1 与其他坏死性凋亡相关蛋白形成复合物（“复合物 IIb”），并形成高度不溶性结构，留在细胞裂解物的不溶部分中。

正如预期的那样，RIPK1 抑制剂 Necrostatin-1s 通过阻断 RIPK1 的自身磷酸化，阻止 TNF-α 诱导的坏死性凋亡启动。

在这两个实验中，还监测了 α- 微管蛋白的水平。结果显示，这种管家蛋白的水平未发生变化，表明观察到的磷酸化 RIPK1 和总 RIPK1 的变化是由药物处理引起的，而非坏死性凋亡晚期可能发生的细胞脱落所致。

参考文献：

Zhu et al. Cell Death and Disease (2018) 9:500
Lee et al. Cell Death and Disease (2019) 10:923

使用 RIPK1 抑制剂预防 HT-29 细胞中坏死性凋亡的激活

将人结直肠癌细胞系 HT-29 以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。先用 25μM Z-VAD 预处理细胞 20 分钟，然后加入递增剂量的 Necrostatin-1s 或 Necrostatin-1。10 分钟后，加入含有 100ng/mL TNF-α 和 100nM SM-164 的预混液，处理 6 小时。处理后，用 50μL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测时，将 16μL 细胞裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）或总 RIPK1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

RIPK1 抑制剂 Necrostatin-1 及其类似物 Necrostatin-1s 均以剂量依赖性方式降低 RIPK1 在丝氨酸 166 位点的自身磷酸化，并且相反地，以剂量依赖性方式增加细胞裂解物可溶性部分中的总 RIPK1。正如预期的那样，基于磷酸化 RIPK1 和总 RIPK1 的 IC50 和 EC50 值（比 Necrostatin-1 好约 3 倍），Necrostatin-1s 比原始小分子更有效。

使用 Necrostatin-1s 抑制 SH-SY5Y 细胞中 RIPK1 激酶活性

将人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。先用 25μM Z-VAD 预处理细胞 20 分钟，然后加入递增剂量的 Necrostatin-1s。10 分钟后，加入含有 100ng/mL TNF-α 和 100nM SM-164 的预混液，处理 6 小时。处理后，用 25μL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测时，将 16μL 细胞裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）或总 RIPK1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

Necrostatin-1s 也能够阻止神经细胞中坏死性凋亡通路的启动，这可通过其对 RIPK1 丝氨酸 166 位点自身磷酸化的抑制来证明。在该细胞系模型中，未观察到总 RIPK1 的调节。

HTRF 磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）检测与蛋白质印迹法的比较

将人结直肠癌细胞系 HT-29 在 T175 培养瓶中用完全培养基培养 48 小时，条件为 37°C、5% CO₂。先用 25μM Z-VAD 预处理细胞 30 分钟，然后同时加入 100nM SM-164 和 100ng/mL 人 TNF-α，处理 6 小时。处理后，用 3mL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166）检测时，12,500 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 25,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 磷酸化 RIPK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

简化通路

RIPK1 信号通路

RIPK1 是细胞命运决定的主要调节因子，它调控细胞存活、凋亡和坏死性凋亡通路。

当 TNF-α 与 TNFR1 结合后，该受体通过招募多种蛋白质（包括 RIPK1、TRADD、TRAF2 以及细胞凋亡抑制因子 1 和 2（cIAP1/2）），在细胞质膜上快速形成复合物 I。cIAP1/2 催化 RIPK1 的多泛素化，进而招募 IKKα 和 IKKβ，并激活 NF-κB 促存活通路。

在缺乏 cIAP1/2 的情况下，RIPK1 从 TNFR1 释放出来，与 FADD 和半胱天冬酶 8 结合形成胞质复合物 IIa，该复合物负责半胱天冬酶 8 依赖性的细胞凋亡。

当半胱天冬酶 8 活性受到抑制或在病理条件下，RIPK1 与 RIPK3 和 MLKL 相互作用，形成胞质复合物 IIb（也称为 “坏死小体”），该复合物参与坏死性凋亡的启动。RIPK1 通过在丝氨酸 166 位点发生自身磷酸化而激活，这对该复合物的形成至关重要，并通过磷酸化作用触发 RIPK3 和 MLKL 的激活。MLKL 是坏死性凋亡最下游的效应因子：该蛋白质发生寡聚化并转移到质膜，导致细胞膜破裂和损伤相关分子模式（DAMPs）的释放。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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HTRF RIPK1 P-S166 KIT - 50K PTS

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