概述
Total-RIPK1 检测可监测总 RIPK1，且能与磷酸化 - RIPK1（Ser166）试剂盒配合作为归一化检测。它与磷酸化 RIPK1 检测所用的缓冲液兼容，同一份裂解液可用于分析磷酸化蛋白群体和总蛋白群体。受体相互作用丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 1（也称为 RIP1 或 RIP）是凋亡和坏死性细胞死亡以及炎症通路（如 TNFR1 和其他受体通路）的介质。丝氨酸 166 位的自身磷酸化被视为 RIPK3/MLKL 依赖性坏死性凋亡启动的生物标志物。坏死性凋亡是一种程序性坏死性细胞死亡通路，也称为 “炎症性细胞死亡”，与包括炎症性疾病、神经退行性疾病以及癌症在内的多种病理状态密切相关。因此，它已成为制药行业重要的药物靶点。治疗策略包括开发特异性小分子激酶抑制剂，如著名的 Necrostatin - 1 和 Necrostatin - 1s。
工作原理
Total - RIPK1 检测原理
HTRF 总 RIPK1 检测可定量细胞裂解物中 RIPK1 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 RIPK1 检测使用两种标记抗体：一种偶联有供体荧光团，另一种偶联有受体荧光团。这两种抗体都对该蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 RIPK1 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达的方法。
总 RIPK1 双板检测方案
双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后加入总 RIPK1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。
总 RIPK1 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 RIPK1 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。
检测验证
RT - 112/84 细胞中 RIPK1 激酶活性的调节
将人膀胱癌细胞系 RT - 112/84 以每孔 200,000 个细胞的密度接种在 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。在 RIPK1 激活实验中，先用 25μM Z - VAD（泛半胱天冬酶抑制剂）处理细胞 30 分钟，然后同时加入 100nM 的 SM - 164（cIAP1/2 抑制剂）和不同浓度的人 TNF - α，处理 6 小时。在 RIPK1 抑制实验中，先用 25μM Z - VAD 处理细胞 20 分钟，然后加入递增剂量的 Necrostatin - 1s。再过 10 分钟后，加入含有 100ng/mL TNF - α 和 100nM SM - 164 的预混液，处理 6 小时。处理后，用 50μL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测步骤中，将 16μL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4μL HTRF 磷酸化 RIPK1（Ser166）或总 RIPK1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。
在存在分别阻断细胞存活和凋亡的 SM - 164 和 Z - VAD 的情况下，TNF - α 诱导 RIPK1 在 Ser166 位的自身磷酸化呈剂量依赖性增加，这表明坏死性凋亡通路被激活。与文献（1,2）一致，总 RIPK1 水平呈反向调节，这是由于 RIPK1 与其他坏死性凋亡伙伴（“复合物 IIb”）结合，并形成高度不溶性结构，该结构保留在细胞裂解物的不溶性部分中。
如预期的那样，RIPK1 抑制剂 Necrostatin - 1s 通过阻断 RIPK1 的自身磷酸化来阻止 TNF - α 诱导的坏死性凋亡启动。
在这两个实验中，还监测了 α - 微管蛋白的水平。结果显示该管家蛋白的水平未发生变化，表明观察到的磷酸化 RIPK1 和总 RIPK1 的变化是由药物处理引起的，而不是由坏死性凋亡晚期可能发生的细胞脱落导致的。
Zhu 等人，《细胞死亡与疾病》（2018）9:500
Lee 等人，《细胞死亡与疾病》（2019）10:923
使用 RIPK1 抑制剂在 HT - 29 细胞中预防坏死性凋亡激活
将人结直肠癌细胞系 HT - 29 以每孔 100,000 个细胞的密度接种在 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。先用 25μM Z - VAD 处理细胞 20 分钟，然后加入递增剂量的 Necrostatin - 1s 或 Necrostatin - 1。再过 10 分钟后，加入含有 100ng/mL TNF - α 和 100nM SM - 164 的预混液，处理 6 小时。处理后，用 50μL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测步骤中，将 16μL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4μL HTRF 磷酸化 RIPK1（Ser166）或总 RIPK1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。
RIPK1 抑制剂 Necrostatin - 1 及其类似物 Necrostatin - 1s 均诱导 RIPK1 在 Ser166 位的自身磷酸化呈剂量依赖性降低，反之，细胞裂解物可溶性部分中的总 RIPK1 呈剂量依赖性增加。如预期的那样，基于在磷酸化 RIPK1 和总 RIPK1 上获得的 IC50 和 EC50 值（比 Necrostatin - 1 好约 3 倍），Necrostatin - 1s 比原始小分子更有效。
使用 Necrostatin - 1s 抑制 SH - SY5Y 细胞中 RIPK1 激酶活性
将人神经母细胞瘤细胞系 SH - SY5Y 以每孔 200,000 个细胞的密度接种在 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。先用 25μM Z - VAD 处理细胞 20 分钟，然后加入递增剂量的 Necrostatin - 1s。再过 10 分钟后，加入含有 100ng/mL TNF - α 和 100nM SM - 164 的预混液，处理 6 小时。处理后，用 25μL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测步骤中，将 16μL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4μL HTRF 磷酸化 RIPK1（Ser166）或总 RIPK1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。
Necrostatin - 1s 也能够阻止神经元细胞中坏死性凋亡通路的启动，这可通过 RIPK1 在 Ser166 位的自身磷酸化受到抑制来表明。在该细胞系模型中，未观察到总 RIPK1 的调节。
HTRF 总 RIPK1 检测与蛋白质印迹法的比较
将人结直肠癌细胞系 HT - 29 在 T175 培养瓶中使用完全培养基培养 48 小时，条件为 37°C、5% CO₂。先用 25μM Z - VAD 处理细胞 30 分钟，然后同时加入 100nM 的 SM - 164 和 100ng/mL 的人 TNF - α，处理 6 小时。处理后，用 3mL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。
使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将每一种稀释液的 16μL 转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 总 RIPK1 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的并列比较。
使用 HTRF 总 RIPK1 检测时，每孔 3,120 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 25,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总 RIPK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 8 倍。
简化通路
RIPK1 信号通路
RIPK1 是细胞命运决定的主要调节因子，它调控细胞存活、凋亡和坏死性凋亡通路。
当 TNF - α 与 TNFR1 结合后，该受体通过招募多种蛋白质（包括 RIPK1、TRADD、TRAF2 以及细胞凋亡抑制因子 1 和 2（cIAP1/2））在细胞质膜上快速形成复合物 I。cIAP1/2 催化 RIPK1 的多泛素化，从而招募 IKKα 和 IKKβ 并激活 NF - κB 促存活通路。
在缺乏 cIAP1/2 的情况下，RIPK1 从 TNFR1 释放出来，并与 FADD 和半胱天冬酶 8 结合，形成负责半胱天冬酶 8 依赖性细胞凋亡的胞质复合物 IIa。
当半胱天冬酶 8 活性受到抑制或在病理条件下，RIPK1 与 RIPK3 和 MLKL 相互作用，形成参与坏死性凋亡启动的胞质复合物 IIb（也称为 “坏死小体”）。RIPK1 通过在 Ser166 位自身磷酸化而激活，这对该复合物至关重要，并通过磷酸化触发 RIPK3 和 MLKL 的激活。MLKL 是坏死性凋亡最下游的效应因子：该蛋白发生寡聚化并转运到质膜，导致细胞膜破裂和损伤相关分子模式（DAMPs）的释放。
规格
其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
总（蛋白）
产品类别
试剂盒
样品体积
16μL
运输条件
干冰运输
目标类别
磷蛋白
目标物种
人
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR - FRET）
治疗领域
炎症
神经科学
肿瘤学与炎症
单位规格
50,000 个检测点
