当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF SHP2 P-Y542 KIT - 50K PTS

HTRF SHP2 P-Y542 KIT - 50K PTS

分享给好友

rvty_ls_sds_64SH2PEY_US rvty_ls_sds_64SH2PEY_UK rvty_ls_sds_64SH2PEY_SPA rvty_ls_sds_64SH2PEY_ITA rvty_ls_sds_64SH2PEY_ELL rvty_ls_sds_64SH2PEY_DEU rvty_ls_sds_64SH2PEY_FRA

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

这种基于细胞的检测方法旨在监测 SHP2 在酪氨酸 542（Tyr542）位点的磷酸化，这是其激活的标志性特征。

许多癌细胞会过度表达检查点抑制剂配体，如 PD-L1。PD-L1 与其对应的检查点抑制剂受体 PD1 结合，而 PD1 存在于 T 淋巴细胞表面。反过来，PD1-PDL1 复合物会招募并激活抑制性效应分子，如 SHP1 或 SHP2。这两种磷酸酶分别在酪氨酸 564（Tyr564）和酪氨酸 542（Tyr542）位点被激酶 Lck 磷酸化，进而触发 T 细胞激活通路中涉及的信号蛋白（如 ZAP-70 或 SLP-76）的去磷酸化。最终，被激活的 SHP1 和 SHP2 会参与 T 细胞的失活过程。

研究认为，通过小分子抑制剂阻止 SHP1 和 / 或 SHP2 的激活，有助于恢复机体对肿瘤的免疫应答。

工作原理

磷酸化 SHP2（Tyr542）检测原理

磷酸化 SHP2（Tyr542）检测用于测量在 Tyr542 位点发生磷酸化的 SHP2。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

phospho-shp2-y542-assay-principle

磷酸化 SHP2（Tyr542）双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移至 384 孔低体积检测板中，再加入磷酸化 SHP2（Tyr542）HTRF 检测试剂。此方案能够监测细胞的活力和汇合度。

phospho-shp2-y542-2-plate-assay-protocol

磷酸化 SHP2（Tyr542）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 SHP2（Tyr542）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，且无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

phospho-shp2-y542-1-plate-assay-protocol

检测验证

在 Jurkat 细胞中，可在过钒酸盐存在的情况下检测到 SHP2 的磷酸化

将人 Jurkat 悬浮细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔半面积板中，在有或无 30μM 过钒酸盐的条件下孵育 30 分钟。孵育后，加入 10μL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。然后将 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2（Tyr542）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在 Jurkat 细胞中，SHP2 的磷酸化是瞬时的，因此其检测具有一定难度。过钒酸盐通过抑制磷酸酶的活性，可防止 SHP2 的快速去磷酸化，从而能够清晰地检测到磷酸化的 SHP2。

assay-validation-shp2-phospho-y542-1

使用 Lck 抑制剂萨拉卡替尼在 Jurkat T 细胞中进行药理学验证

将人 Jurkat 悬浮细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔半面积板中，在 37°C、5% CO₂条件下，与不同浓度的萨拉卡替尼共同孵育 24 小时。裂解前，Jurkat 细胞与 30μM 过钒酸盐孵育 30 分钟，随后加入 10μL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2（Tyr542）或总 SHP2 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

如其他文献所述，用萨拉卡替尼处理后，SHP2 Tyr542 位点的磷酸化受到剂量依赖性抑制，而在相同实验条件下，SHP2 的表达水平保持稳定。

assay-validation-shp2-phospho-y542-2

在经 PDGF 刺激的 NIH-3T3 小鼠细胞上进行药理学验证

将小鼠 NIH 3T3 贴壁细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。血清剥夺过夜后，用不同浓度的 PDGF 刺激细胞 20 分钟。收集细胞培养液，并用 50μL 补充裂解缓冲液裂解细胞。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16μL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2（Tyr542）或总 SHP2 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

结果显示，PDGF 刺激可诱导 NIH3T3 细胞中 SHP2 Tyr542 位点发生强烈的磷酸化，而在相同实验条件下，SHP2 的表达保持稳定。

assay-validation-shp2-phospho-y542-3

HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将人 Jurkat 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。然后用 30μM 过钒酸盐处理细胞 30 分钟，之后进行裂解。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16μL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 磷酸化 SHP2 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 SHP2 Y542 检测时，每孔仅需 620 个细胞即可检测到信号，而使用依赖 ECL 检测的蛋白质印迹法则需要 10,000 个细胞。这些结果表明，HTRF 磷酸化 SHP2 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

assay-validation-shp2-phospho-y542-4

简化通路

SHP2 的功能与调控

SHP1（也称为非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 6，PTPN6）是一种主要在造血细胞中表达的酪氨酸磷酸酶，由 Lck 激活并被细胞表面受体招募。SHP2（也称为非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 11）在造血细胞和非造血细胞中均广泛表达。尽管 SHP2 负向调控 T 细胞激活，但它在响应血小板衍生生长因子（PDGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）等生长因子时，正向参与 ERK 的激活。

在 T 淋巴细胞中，SHP1 和 SHP2 被免疫检查点抑制剂招募，从而参与 T 细胞受体（TCR）信号通路的抑制。SHP1 和 SHP2 与 PD1 的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）结构域相互作用，并被 Lck 激酶磷酸化激活。激活的 SHP1 和 SHP2 磷酸酶会导致 TCR 信号通路中的关键效应分子（如 ZAP70 或 SLP76）去磷酸化，而这些分子是 T 细胞增殖和功能所必需的。

pathway-shp2-phospho-y542-kit-64sh2peg

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
目标类别：磷酸化蛋白质
目标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：传染病、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

没有数据

货号：64SH2PEY

一键复制

参考价格 ¥ 545226.97

产品规格

请咨询￥545226.97

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价